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非阻塞性无精子症患者睾丸组织中CircRNA的表达谱和功能分析

摘要

背景

非阻塞性无精子症(NOA)是一种多因素疾病,其分子基础仍然很大程度上未知。环状rna (CircRNAs)是一类新型的内源性rna,在许多生物过程中发挥着重要的作用。然而,关于人类睾丸中参与NOA的环状rna的表达模式和功能知之甚少。

方法

在这项研究中,通过高通量Circrna微阵列探讨了NOA患者和对照的睾丸CircrNA表达谱。进行实时定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)以确认微阵列数据。生物信息学分析包括CiRcRNA / miRNA / mRNA相互作用网络,基因本体(GO)和基因组(Kegg)途径分析的基因本体(GO)和京都百科全书来预测差异表达的Circrnas的功能。

结果

NOA患者中共检测到368个差异下调的circrna和526个差异上调的circrna。这些发现已被6种选定环状rna的qRT-PCR验证。在这些差异表达的环状rna中,hsa_circRNA_0023313在NOA患者睾丸组织中明显上调。hsa_circRNA_0023313最可能的潜在靶miRNA包括hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-302c-3p和hsa-miR-130b-5p。功能分析表明hsa_circRNA_0023313具有泛素-蛋白转移酶活性和染色质结合能力。KEGG分析显示,与hsa_circRNA_0023313相关的5条通路依次为内吞、减数分裂、FoxO信号通路、泛素介导的蛋白水解通路和AMPK信号通路。

结论

这是第一个关于NOA患者睾丸circRNA表达谱发生改变的报道,提示circRNA可能在调控精子发生中发挥重要作用,并可能成为NOA诊断和治疗的潜在生物标志物。

背景

不孕症是一个全球性的生殖健康问题,影响着全球约7000万人[1]。据世界卫生组织估计,10-15%的夫妇面临不孕问题,男性因素约占所有不孕病例的一半[2,3.]遗憾的是,近60-75%的男性不孕症是不明原因或特发性的,因为缺陷的分子机制仍然未知[4,5]。非阻塞性无精子症(NOA)是男性不育最严重的表现,精子发生过程被破坏[6,7]它影响了1%的男性和10%寻求生育援助的人[8]。研究还表明,NOA约占无精子症的60%,在无精子症中,精子发生过程是不活跃的,因此不能产生精子细胞[9]。到目前为止,NOA是一种多因素疾病,其分子基础在很大程度上尚不清楚[6,10]。虽然微生物切割睾丸精子提取(Micro-TESE)是NOA的标准治疗,但是精子检索在大约50%的患者中是不成功的[11]。因此,如何阐明参与精子发生过程的精确分子机制,并发现NOA患者有效的诊断标志物或治疗靶点是一个挑战。

环状rna (CircRNAs)是一种结构稳定、组织特异性高的新型内源性rna [12]。与线性RNA不同,CircrNA形成共价闭合的连续环,允许Circrnas抵抗降解,并且在真核转录组中高度表示[13]。Circrnas比线性RNA更稳定,并且因此可能涉及更丰富的功能。研究表明,Circrnas可以用作MiRNA海绵,剪接和转录调节因子,以及父母基因表达的修饰剂[14]。环状rna被认为是理解疾病的分子机制和识别有效的诊断生物标志物或治疗靶点的重要生物调节因子[15]。最近,据报道,Circrnas参与了许多疾病,如心血管疾病和各种癌症[15,16,17,18,19]。然而,到目前为止,我们对环状rna在男性不育中的表达和功能知之甚少。

因此,本研究旨在探讨NOA患者中环状rna的表达谱和功能。生物信息学分析还用于鉴定circRNA/miRNA/mRNA相互作用网络、生物过程和信号通路。这些结果可能为新型NOA诊断和治疗策略的发展提供潜在的靶点。

材料和方法

病人和样品

该方案得到西安交通大学医学伦理委员会的全面批准。向所有受试者解释本研究的目的,并获得所有受试者的书面知情同意书。NOA患者选自就诊于西北妇幼医院生殖中心不孕症门诊且有不孕病史≥12个月的夫妇。在性禁欲3-7天后进行了3次精液分析。排除慢性疾病、低雄激素血症、性腺功能减退、盆腔/脊柱损伤史、核型异常及Y染色体AZF区微缺失的患者。根据世界卫生组织(WHO) 2010年的指南,所有NOA患者都是通过检测三次射精中没有精子的精液样本,包括整个球的高速离心[20.,21,22,23]。

最后,从NOA(25-46岁年龄段)的50名患者获得睾丸样品。理想的正常控制应包括已知生育能力的志愿者,但获取睾丸样品的困难使其变得不切实际。因此,50名患者(25-40岁)与阻塞性偶氮症(OA),其睾丸组织病理学检查所显示的正常精子发生作为对照。其中,3患者睾丸组织病理学检查显示早熟停滞和3个对照进一步用于CircrNA微阵列标记和杂交。

RNA提取与质量控制

根据制造商的指示(Invitrogen,Carlsbad,California,USA),从睾丸活组织检查中提取总RNA。为了降低群间差异,我们分别在NOA和对照组中混合三个睾丸组织样品用于随后的CircRNA微阵列标记和杂交。通过使用NanoDrop ND-1000分光光度计检查RNA定量和质量。通过使琼脂糖凝胶电泳进行降解琼脂糖凝胶电泳来测试RNA完整性和GDNA污染。

CircRNA微阵列标记和杂交

样品制备和微阵列杂交是基于康成公司(中国上海)的Arraystar标准方案。首先用Rnase R (Epicentre, Inc.)对两组总rna进行酶切,分别去除线性rna和富集环状rna。其次,扩增富集的环状RNA,采用随机引物法将其转录为荧光cRNA (Arraystar Super RNA Labeling Kit;Arraystar)。第三,将标记的crna杂交到Arraystar Human circRNA Array (8x15K, Arraystar)上。最后,洗好载玻片后,用安捷伦扫描仪G2505C对阵列进行扫描。

微阵列数据收集和分析

简而言之,通过使用Agilent特征提取软件(版本11.0.1.1)来分析获取的阵列图像。使用R软件包执行定量标准化和后续数据处理。通过散射绘图滤波探讨了两组之间具有统计显着性的差异表达的CircRNA。通过折叠变化滤波识别样品之间的差异表达的CircrNA。执行分层聚类以显示样本之间的可区分Circrnas表达模式。

QRT-PCR验证CircrNA

采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)对circRNA芯片数据进行验证。在50对新鲜冷冻睾丸组织样本(50份来自NOA, 50份来自OA)中,选择6个差异表达的circrna(包括3个上调和3个下调)进行qRT-PCR实验。为环状rna设计的特异性引物列于表中1。引物由青岛科生物技术有限公司(中国北京)合成。

表1引物序列

首先,使用日本Takara公司的MiniBEST通用RNA提取试剂盒(minbest Universal RNA Extraction Kit),按照制造商的协议,制备睾丸样本的总RNA。其次,用HiFiScript cDNA合成试剂盒(CWBIO,中国)在20 μl的反应体积中将总RNA逆转录成cDNA。第三,利用UltraSYBR Mixture (High ROX) (CWBIO, China)在Bio CFX Connect实时PCR分析仪(Bio- red, USA)上进行实时PCR。将5 μl UltraSYBR Mixture (2×),正向引物和反向引物各0.3 μl, cDNA各10 ng混合,总反应量为10 μl。反应条件为:95°C初始孵育10 min, 95°C变性10s, 57°C退火30s, 72°C延长32 s,循环40次。所有实验均为3个重复,通过比较2,取平均Ct值计算circRNA的相对表达量-Ct方法。

CircRNA/miRNA相互作用和CircRNA/miRNA /mRNA调控网络分析

为了识别选定的环状rna的潜在功能,我们使用Arraystar自制的基于miRanda的miRNA靶标预测软件来预测环状rna /miRNA的相互作用[24]及TargetScan (http://www.targetscan.org)[25]。使用CircRNA / miRNA相互作用信息详细注释差异表达的圆锥。此外,根据Starbase v2.0靶向miRNA的靶基因进一步预测CircRNA / miRNA / mRNA调节网络(http://starbase.sysu.edu.cn/)[26]及miRDB (http://mirdb.org)[27]。

生物信息学分析

基于DAVID 6.8 (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),我们进行了基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析。GO分析用于鉴定环状rna靶向基因在细胞成分、生物学过程和分子功能方面的功能作用。采用KEGG分析,探索环状rna靶向基因的相关通路。

统计分析

所有数据均以均数±标准差(SD)来描述。所有统计分析均采用SPSS统计软件18.0版本(SPSS, Chicago, USA)进行P< 0.05为差异有统计学意义。采用配对t检验分析NOA组和对照组睾丸组织样本中CircRNA的表达谱。选择fold changes(≥2)的CircRNAs作为显著差异表达,计算错误发现率(FDR)来校正P微阵列分析结果的价值。通过Pearson的相关方法评估CircRNA和Cerna的相对表达与核心之间的相关性。

结果

对照组和NOA睾丸中环状rna的差异表达

分级聚类图显示了NOA患者和对照组睾丸组织中circRNA的表达谱(图。1a). Box图显示,经过归一化处理后,NOA和对照中环状rna的分布几乎相同(图。1b).散点图显示了在NOA和对照组之间circRNA表达的变化(图。1c).散点图中X、Y轴的值为样本的归一化信号值(log2缩放)或组样本归一化信号值的平均值(log2缩放)。绿色的线是折叠变化线。上绿线以上和下绿线以下的环状rna表明两个比较样本之间的环状rna变化超过2.0倍。如果环状rna上调或下调至少两倍,则被认为具有显著差异表达。

图1
图1

NOA患者睾丸组织中差异表达的circRNA分析一个所有表达Circrnas的分层聚类图片。“红色”表示高相表达,“绿色”表示低相对表达。bBox图显示,经过归一化处理后,对照组和NOA组样本中环状rna的分布基本相同。c散点图显示了在NOA和对照之间circRNA表达的变化。位于上绿线以上和下绿线以下的环状rna表明其变化超过2.0倍。d饼状图显示了基于基因组起源的差异表达环状rna

共检测到4169人的Circrnas。其中,鉴定了526个人CircrNA,与对照组(AFC> 2.0和AFC> 2.0和)相比,在NOA患者的睾丸组织中下调368次。P< 0.05)。根据人Circrnas的基因组来源,饼图中总结了差异表达的Circrnas的分类(图。1d).大多数属于外显子环状rna。其中,526个上调的环状rna包括479个外显子,26个内含子,8个反义和13个基因内。此外,368个下调的环状rna包括316个外显子,31个内含子,6个反义和15个基因内(图。1d)。

用qRT-PCR验证微阵列数据

为了验证circRNA微阵列结果,我们随机选取6个差异表达的circRNA进行qRT-PCR分析,包括上调的3个circRNA (hsa_circ_0058058、hsa_circ_0008045、hsa_circ_0023313)和下调的3个circRNA (hsa_circ_0061817、hsa_circ_0002023、hsa_circ_0058058、hsa_circ_0008045、hsa_circ_0023313),和hsa_circ_0008533)。结果表明,所选择的环状rna的表达模式与微阵列数据一致。2),其中hsa_circ_0023313 (Control 1.30±1.33,NOA 16.46±2.81,P= 0.002),HSA_CIRC_0008045(控制1.00±0.32,NOA 4.12±0.51,P= 0.00035)和hsa_circ_0058058 (Control 0.98±0.43,NOA 16.93±1.48,P= 0.0004)上调,HSA_CIRC_0061817(控制1.04±0.24,NOA 0.58±0.19,P= 0.061), hsa_circ_0002023(控制1.00±0.29,0.46±0.13诺亚,P= 0.01), hsa_circ_0008533 (Control 0.99±0.26,NOA 0.60±0.16,P= 0.012),与对照组相比,NOA患者表达下调。

图2
figure2

circRNA微阵列数据的qRT-PCR确认。qRT-PCR分析证实了circRNA芯片的数据。Hsa_circ_0023313 (Control 1.30±1.33,NOA 16.46±2.81,P= 0.002),HSA_CIRC_0008045(控制1.00±0.32,NOA 4.12±0.51,P= 0.00035)和hsa_circ_0058058 (Control 0.98±0.43,NOA 16.93±1.48,P= 0.0004)。Hsa_circ_0061817(对照1.04±0.24,NOA 0.58±0.19,P= 0.061), hsa_circ_0002023(控制1.00±0.29,0.46±0.13诺亚,P= 0.01), hsa_circ_0008533 (Control 0.99±0.26,NOA 0.60±0.16,P与对照相比,在NOA患者中= 0.012)下调。(*P< 0.05,与对照组比较)

CircRNA / miRNA互动分析

已经证明Circrnas作为miRNA“海绵”,竞争抑制miRNA活性并进一步调节基因表达。为了发现NOA中的潜在圆形/ miRNA相互作用,选择一个确认的CiRcRNA(HSA_CIRCRNA_0023313)进行进一步的生物信息学分析和预测。

对于hsa_circRNA_0023313,最可能的潜在靶mirna是hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-302c-3p和hsa-miR-130b-5p。miRNA响应元件(MREs)序列分析如图所示。3.。“2D结构”展示了MRE序列、靶miRNA种子类型和3’配对序列。“Local AU”表示种子上游和下游30 nt的AU含量。红条代表A/U和高可及性,黑条代表G/C和低可及性。此外,可达性的程度可以通过条形的高度来体现。“Position”表示hsa_circRNA_002313线性表示中最可能的相对MRE位置。

图3
图3

hsa_circRNA_0023313的circRNA/miRNA相互作用信息预测。hsa_circRNA_0023313与3 ' -UTR中hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-302c-3p和hsa-miR-130b-5p位点结合的结果

circRNA/miRNA/mRNA相互作用网络的预测

circRNA/microRNA/mRNA相互作用网络图4)基于hsa_circrna_0023313靶向mirna(包括hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-302c-3p和hsa-miR-130b-5p)的预测靶基因,由Cytoscape (https://cytoscape.org/)[28]。

图4
装具

基于hsa_circrna_0023313靶向miRNAs预测靶基因的CircRNA/miRNA/mRNA相互作用网络图。中间的黄色方块代表hsa_circRNA_0023313。不同颜色的三角形代表hsa_circRNA_0023313的潜在靶标mirna。不同颜色的圆形代表hsa_circrna_0023313靶向miRNAs潜在的相应靶基因(mRNA)

图5
figure5

对has_circ_0023313进行Go分析和KEGG通路分析。一个has_circ_0023313靶基因的细胞成分分析bαcirc_0023313靶向基因的生物过程分析;chas_circ_0023313靶基因的分子功能分析dhas_circ_0023313的KEGG通路分析

Go分析和KEGG路径分析

采用Go分析和KEGG通路分析预测hsa_circRNA_0023313的潜在生物学功能。

如图所示。5对于HSA_CIRCRNA_0023313,细胞分量分析显示其靶基因主要涉及细胞质,细胞溶质和自噬磁体和自噬体(图。5a).生物学过程分析显示,其目的基因主要参与转录的正调控、dna模板、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、共价染色质修饰等(图)。5b)。此外,分子函数分析表明HSA_CIRCRNA_0023313主要参与泛素蛋白转移酶活性,染色质结合和ATP结合等(图。5c)。

KEGG分析显示,hsa_circRNA_0023313相关的前5个信号通路分别是内吞、减数分裂、FoxO信号通路、泛素介导的蛋白水解通路和AMPK信号通路(图5)。5d)。

讨论

据我们所知,这是首个确定NOA患者睾丸组织中综合环状rna表达模式的研究。芯片数据显示,368个circrna下调,526个circrna上调(aFC > 2.0和P< 0.05)。通过对随机选取的环状rna (hsa_circ_0023313、hsa_circ_0058058、hsa_circ_0008045、hsa_circ_0061817、hsa_circ_0002023和hsa_circ_0008533)进行qRT-PCR检测,证实了这些发现。进一步的系统生物信息学分析包括circRNA/miRNA/mRNA相互作用网络、GO和KEGG通路分析,用于预测差异表达circRNA的功能,提示circRNA可能在调控精子发生中发挥重要作用。

精子发生,即精原细胞向精子的转化,是一个精心安排和精确调控的生物过程,严格受阶段性特异性基因表达的调控[4,29,30.,31]。非编码rna如microRNAs (miRNAs)、piwi相互作用rna (piRNAs)和长链非编码rna (lncRNAs)在精子发生的多个阶段中是重要的转录后基因表达调控因子[32.,33.]。环状rna是一类保守的内源性非编码rna,可以调节基因表达[33.]。它可能是人类转录中最大的RNA家族[33.]。与线性rna不同,环状rna形成一个共价闭合的连续环,在真核转录组中有很高的代表性[13]。因此,环状rna具有高度的保守性和稳定性,因此可能参与更丰富的功能[19]。Dong等报道了circRNAs在人睾丸中的表达丰富,正常人睾丸中有15996个circRNAs参与精子发生过程中精确的基因表达调控,他们的测序数据已公开在SRA数据库中[33.]。

通过环状rna芯片和qRT-PCR分析,我们比较了NOA和对照组睾丸组织中环状rna的表达模式。我们的芯片结果显示368个环状rna下调,526个环状rna上调。为验证微阵列数据,随机选取6个差异表达的环状rna,采用qRT-PCR方法检测50对睾丸组织。芯片数据和qRT-PCR结果的一致性进一步提示环状rna可能在调控精子发生中发挥重要作用。同时,我们与正常人睾丸circRNA深度序列数据库(SRX2254041)进行比对,我们选择的6个circRNA全部纳入该数据库,每个circRNA都发生了变化[33.]。在这些异常调控的环状rna中,hsa_circRNA_0023313在NOA患者中的表达显著增强,这表明其可能在调控精子发生过程中发挥重要作用,并可能在NOA的诊断、治疗中发挥潜在的生物标志物作用。

CircRNA/miRNA/mRNA相互作用网络预测可以全面了解hsa_circRNA_0023313的生物学功能。我们的circRNA/miRNA相互作用分析显示,hsa_circRNA_0023313最可能的潜在靶miRNA包括hsa-miR-373-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-520d-3p、hsa-miR-302c-3p和hsa-miR-130b-5p。Liu等的研究表明,hsa-miR-373和hsa-miR-372在精子异常的不育男性精子中存在调控异常,这可能与不育男性精子异常有关[34.]。此外,Syring等报道睾丸生殖细胞瘤患者血清hsa-miR-373-3p和hsa-miR-372-3p水平显著高于健康个体和非恶性睾丸疾病患者[35.]。Hansen等人的研究发现睾丸特异性circRNA,性别决定区Y (Sry)作为miR-138海绵,提示通过形成circRNA实现miRNA海绵效应是一种普遍现象[36.]。已经表明,Circrnas用作竞争性地抑制miRNA活性的miRNA“海绵”,并进一步调节靶基因表达,并在正常人体睾丸中存在,从而有助于疾病的发展[14,33.]。在本研究中,HSA_CIRCRNA_0023313在NOA患者中调节,表明HSA_CIRCRNA_0023313可以通过抑制miRNA活性来抑制精子发生。

环状rna可能与线性rna竞争,通过将miRNA与miRNA响应元件(MREs)结合,强烈抑制miRNA活性,导致miRNA靶基因水平增加[36.]。在我们的研究中,我们发现hsa-miR-372-3p的假定靶基因包括自噬相关基因如rab24 [37.越来越多的证据表明自噬在男性不育的发病机制中起着关键作用[30.,38.]。此外,我们的数据显示,hsa-miR-373-3p的假定靶基因包括泛素特异性蛋白酶基因,如USP24。最近的研究也报道了USP24是ar靶基因,USP24基因表达的增加与性发育的启动有关,可能参与调控小鼠精子发生[39.]。hsa_circRNA_0023313可能通过与miRNA竞争结合来增加这些靶基因的表达。我们推测hsa_circRNA_0023313/ miR-372-3p / rab24通路和/或hsa_circRNA_0023313/ miR-373-3p / USP-24通路可能通过调控精子发生,这高度反映了ceRNA调控网络的作用。然而,详细的分子机制的验证实验是未来需要的。

同时,采用Go分析和KEGG通路分析预测hsa_circRNA_0023313的潜在生物学功能。细胞成分分析显示,hsa_circRNA_0023313的靶基因主要参与细胞质、细胞质和自噬小体。生物学过程分析表明,其目的基因主要参与转录的正向调控、dna模板调控和RNA聚合酶II启动子转录的正向调控。分子功能分析表明,主要集中在泛素-蛋白转移酶活性、染色质结合和atp结合等方面。KEGG分析显示,与hsa_circRNA_0023313相关的前5个信号通路分别为内吞、减数分裂、FoxO信号通路、泛素介导的蛋白水解通路和AMPK信号通路。这些数据表明,hsa_circRNA_0023313可能与精子发生的发生和发展密切相关。

结论

综上所述,本研究首次阐明了环状rna在NOA患者睾丸组织中的全面表达模式,提示环状rna可能在调控精子发生中发挥重要作用,并可能成为NOA诊断和治疗的潜在分子靶点。但环状rna在精子发生过程中具体作用的分子机制有待进一步探索。

数据和材料的可用性

支持本文结论的数据集包含在本文中。

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下载参考

致谢

作者感谢所有参与这项研究的受试者。此外,他们感谢所有技术人员的合作和对这项研究的贡献。

资金

本研究由国家自然科学基金资助(81673224;81273018;30700654),陕西省自然科学基金资助项目(2019JM029;2018 jm7135;中央大学基本科研业务费专项资金(XJJ 2011024);西安交通大学医学研究生自主创新实验项目(YJSCX-2017-007和YJSCX-2018-011)。

作者信息

从属关系

贡献

PG, JZ和LZ在DXZ的指导下设计了这个项目。LZ提供睾丸组织活检及患者临床检查结果。GP进行了生物信息学分析。PG, YXL, JW在MQL技术支持下进行了实验。该手稿由DXZ撰写,由PG和JZ投稿。图示由DXZ绘制。所有作者阅读并批准最终稿件。

相应的作者

对应于金王Dang-xia周

道德声明

伦理批准并同意参与

本研究中进行的所有程序涉及西安交通大学制度医学伦理委员会的道德标准。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

额外的信息

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关于这篇文章

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引用这篇文章

葛平,张军,周磊。et al。非阻塞性无精子症患者睾丸组织中CircRNA的表达谱和功能分析。天线转换开关性杂志17,100(2019)。https://doi.org/10.1186/s12958-019-0541-4

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关键字

  • CircRNA
  • 精子发生
  • Non-obstructive精子缺乏(诺亚)
  • 微阵列
  • 生物信息学分析
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