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皮质醇对牛子宫内膜上皮细胞的增殖作用

抽象的

背景

牛子宫内膜上皮细胞(BEECs)在犊牛后经常再生。由于各种应力,在产后牛中报道了升高的皮质醇浓度。然而,尚未报告皮质醇生理水平对贝ECS增殖的影响。本研究的目的是调查皮质醇是否会影响Beecs的增殖性质,并澄清可能的潜在机制。

方法

Beecs被不同浓度的皮质醇(5,15和30ng / ml)治疗。通过定量逆转录 - 聚合酶链反应(QPCR)检测各种生长因子的mRNA表达,使用流式细胞术分析测量贝氏细胞周期的进展,以及Wnt /β-catenin和磷脂酰肌醇3-激酶的活化(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)用蛋白质印迹和免疫荧光检测信号传导途径。

结果

皮质醇处理导致血管内皮生长因子(VEGF)和结缔组织生长因子(CTGF)的上调mRNA水平;然而,它对转化生长因子-β1(TGF-β1)没有影响。皮质醇(15ng / ml)加速了从G0 / G1到S相的细胞循环过渡。皮质醇上调β-catenin,c-myc和cyclind1的表达,并促进了pi3k和akt的磷酸化。

结论

这些结果表明,皮质醇通过增加一些生长因子的表达并激活Wnt /β-catenin和Pi3k / akt信号传导途径来促进Beecs中的增殖。

背景

哺乳动物子宫具有独特的再生能力,因为它经历了变性和再生的循环计划。在分娩期间,牛子宫内膜上皮细胞(Beecs)部分被破坏[1].随后,在没有剩余的瘢痕组织或功能丧失的情况下有效修复受损的子宫内膜[2].这种修复对于准备另一个怀孕并形成针对各种致病微生物的自然防御障碍是必不可少的。

皮质醇作为一种内源性糖皮质激素,可以通过压力在机体中产生[3.].产妇血液中的皮质醇水平升高。先前的研究表明,糖皮质激素由于其细胞毒性作用和诱导细胞周期阻滞和凋亡而抑制细胞增殖[4.].然而,越来越多的研究表明,糖皮质激素可以在各种细胞类型中促进增殖[5.6.7.].Petersen等人已经证明,低剂量地塞米松治疗可导致培养的人晶状体上皮细胞的增殖适度增加[7.].Komiyama等。据报道,皮质醇抑制了损伤细胞的凋亡,在早期和中脑阶段维持牛毒素的旋毛功能[8.].这些研究解释了为什么将低浓度的皮质醇作为生长增强剂添加到一些培养基中[9.].糖皮质激素的效果取决于细胞的分化状态[10.].糖皮质激素治疗可降低未分化的细胞增殖,而促进分化细胞存活率[11.].Ciliberti等。事实证明,生理皮质醇浓度可以在压力后促进外周血单核细胞增殖[12.].许多其他研究报告称皮质醇可以调节牛中的女性生殖功能[13.14.15.].Lee等人。表明皮质醇可以充当旋油应激因素,因为它可以抑制牛子宫内膜基质细胞中的基础和TNFα诱导的PGF2α产生[16.].Duong等人。发现牛肉豆蔻酸的功能受到皮质醇的积极影响,这导致了胚胎植入率较高,孕级妊娠率较高[17.].然而,更少的研究表明皮质醇对贝ECS增殖的影响。

在脱落糖类化学后,坏死的表面子宫内膜的蜕皮驱动子宫内膜表面上皮覆盖物的损失,因此修复过程需要Beecs的生长。新血管形成对于子宫内膜典型,血管为新组织供应氧气,并运输免疫细胞以抑制感染和炎症[18.].VEGF是内皮细胞的特异性丝分裂性,在正常和病理血管生成中起重要作用[19.].它还可以调节正常子宫内膜血管生成。CTGF是多功能生长因子,其在各种细胞和组织中表达,例如上皮和分泌细胞,肝脏薄壁组织和血管细胞。在伤口修复期间,CTGF表达明显升高以促进伤口愈合,结缔组织细胞增殖和细胞粘附[20.21.].TGF-βS可以调节各种细胞类型中的增殖和分化[22.].TGF-β1在子宫内膜生长中具有重要功能。据报道,TGF-β1用作CTGF的强大上游诱导剂[23.24.].

WNT信令与许多器官系统中的修复过程连接[25.].在灵长类动物和小鼠中,已经证明了Wnt /β-catenin信号传导途径参与子宫内膜修复过程,其显示子宫内膜上皮再生过程中子宫内膜的动态变化[26.27.].在静止状态下,β-catenin局部化在细胞质中,其中它与破坏复合物(轴,腺瘤菌症息肉大肠杆菌,糖合酶激酶3β和酪蛋白激酶1α结合。一旦激活了Wnt /β-连环蛋白信号传导途径,将得到的信号转导到破坏复合物以防止β-catenin磷酸化和降解[28.].然后,自由骨溶胶β-catenin进入核以结合T细胞系数/淋巴增强剂因子(TCF / LEF)家族,并调节下游靶基因的表达,例如C-MYC和CYCLIND1,其紧密参与增殖和细胞周期[29.30.].累积证据证实,PI3K / AKT信号通路是一种重要的细胞内信号传导途径,其调节许多细胞功能,包括增殖,粘附,迁移,侵袭,代谢和存活[31.32.33.]PI3K是激活AKT的主要上游分子,然后AKT诱导细胞生长和生存。

本研究的目的是探讨皮质醇对贝ECS的增殖作用,并澄清可能的效果机制。我们的研究旨在检测Wnt /β-catenin和Pi3k / akt信号传导途径的生长因子(VEGF,CTGF和TGF-β1),细胞周期和PI3K / AKT信号传导途径的MRNA水平的变化皮质醇,我们评估了皮质醇是否可以在体外促进BEEC增殖。

方法

子宫内膜上皮细胞的分离和培养

从Abattir中收集没有生殖器疾病或微生物感染的总证据的牛子宫,并在实验室进一步加工冰上进行冰。由于子宫的污染,子宫内膜损伤和局部炎症,产后子宫被丢弃。在雌性循环的第1-4天(第1天代表排卵日)的日子里收集子宫,卵巢阶段我用于细胞培养,因为此时[34.]外周血血浆孕酮浓度与产后牛的血浆浓度相似[1].简而言之,将子宫喇叭切成3-4厘米长的部分。用0.1%蛋白酶消化组织Streptomyces griseus(P5147,Sigma,USA),200个单位/ ml青霉素和200μg/ ml链霉素溶解在DMEM-F12(D8900,Sigma,USA)中。在4℃温育18-H孵育后,纵向切割子宫喇叭以暴露上皮。使用外科刀片和眼科镊子轻轻刮下子宫内膜。收获的子宫内膜以100×g离心5分钟,然后用PBS洗涤两次。然后,收集细胞沉淀。将细胞接种成25厘米2Dulbecco的改良鹰培养基/营养混合物F-12的烧瓶含有15%胎牛血清(FBS,Gibco,USA),50U / ml青霉素/链霉素,并在37℃下培养5%CO2.每1-2天更换培养基,直到细胞达到约90%的融合。免疫组化检测CK-18纯化BEECs,上皮细胞比例大于99%。将BEECs进行播种处理,直至达到80%的合流。BEECs是独立分离培养的。每一组培养细胞都来自单个子宫,代表实验中的一个子宫。每个独立实验的细胞都来自于单个子宫。

RNA提取和定量PCR(QPCR)

我们以前的研究证实,5ng / ml(基础生理学水平),15ng / ml(分娩的生理水平)和30ng / ml(如外源给药或病理条件的次生生理水平)的皮质醇具有没有对Beecs的细胞毒性影响[35.].将贝氏胶片用皮质醇(5,15和30ng / ml)处理0,3,12和18小时。与皮质醇(H0888,Sigma,USA)孵育后,根据制造商的使用TrizoL Reagent(ET111,Tran,China)根据制造商的说明提取总RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo,USA)检查提取的RNA的量和纯度分析。测定吸收比(A260 / A280)的比例在1.8和2.1之间,然后将RNA(900ng)转化为如前所述的cDNA [35.].循环条件如下:95℃,30s,40个循环为95℃,5s,60℃,30秒。反应体系包括12.5μLSYBR绿PCR混合物,每次反应终体体积为25μl的1μLCADAl,以及1μlDNA模板(RR820A,Takara,Japan)。2-CT.方法用于分析相对基因表达(靶向基因表达归一化为内源对照基因的表达)[36.].QPCR实验一式三份进行。引物的序列在表中呈现1

表1用于扩增QPCR的引物序列列表

细胞循环分析

皮质醇(5、15、30 ng/mL)处理BEECs 24 h。收集细胞,用冷PBS洗涤2次,70%乙醇4℃固定24 h。然后用冷PBS洗涤2次,用RNaseA和碘化丙啶(C1052, Beyotime, China)在37°C的黑暗中孵育30分钟。通过流式细胞术测定细胞周期的阶段(LSRFortessa, BD Biosciences, USA)。

Western印迹分析

用上述方法处理beec,用BCA蛋白检测试剂盒(P0010, Beyotime,中国)提取总蛋白并定量。蛋白质(20-30 μg)用10% sds -聚丙烯酰胺凝胶分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,德国)。将膜置于TBST稀释的5%脱脂牛奶(0.1% Tween-20 in Tris-buffered saline)中孵育,以阻止非特异性结合。将膜与β-catenin (5% BSA稀释1:5000)、p-AKT (5% BSA稀释1:2000)、C - myc、cyclinD1、p-PI3K、PI3K、AKT和β-actin (5% BSA稀释1:10 000)特异性一抗在4°C孵育过夜。然后与酶标二抗(在5%脱脂牛奶中稀释1:2000)在室温下孵育1小时。使用的抗体如下:β-catenin (ab32572;Abcam;c-Myc, cyclinD1, p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT和β-肌动蛋白(分别为#5605,#2978,#4228,#4292,#4060,#4691,#4970;Cell Signaling Technology, USA)。

免疫荧光染色

BEECs生长在24孔细胞培养板的盖玻片上。用浓度为15 ng/mL的皮质醇处理细胞30min。处理后,4%多聚甲醛固定细胞30分钟。PBS洗涤后,用0.1%的Triton X-100使细胞膜通透10分钟,在室温下用5%的牛血清白蛋白阻塞细胞30分钟。之后,细胞与抗β-catenin(均在1:50 0的封闭溶液中)在4°C孵育过夜。PBS洗涤三次后,细胞与fitc偶联的二抗(A0423, Beyotime, China)在室温下孵育1小时。细胞核用DAPI (C1005, Beyotime, China)染色。用荧光显微镜(Leica TCS SP8;德国徕卡公司)。

统计分析

uteri从至少3奶牛中取样。使用三种重复(不同的培养细胞)用于分析,并且在每组内重复相同的培养细胞。分析所有数据作为平均值(SEM)的平均值±标准误差。通过单向ANOVA进行比较,然后是Dunnett的测试(SPSS 17.0软件)。一种P.- 低于0.05的值被认为是统计学意义。

结果

通过皮质醇诱导Beecs中VEGF,CTGF和TGF-β1的mRNA表达

为了探讨皮质醇对贝克增殖的潜在影响,我们通过QPCR检查了VEGF,CTGF和TGF-β1的mRNA水平。如图1所示。1, 3 h、12 h时VEGF mRNA水平升高(P. < 0.05) after 5 ng/mL, 15 ng/mL and 30 ng/mL cortisol treatment compared to those in the control group. At 18 h, VEGF expression was higher (P. < 0.05) than it was in the control group after 15 ng/mL and 30 ng/mL but not after 5 ng/mL cortisol treatment. At 3 h, 12 h and 18 h, the mRNA levels of CTGF were significantly upregulated (P. < 0.05) after 15 ng/mL and 30 ng/mL cortisol treatment. The mRNA levels of TGF-β1 in the experimental groups were no different than they were in the control group at the indicated time points.

图。1
图1

皮质醇对VEGF的mRNA表达的影响(一种),CTGF(B.)和TGF-β1(C)在牛子宫内膜上皮细胞中。将牛子宫内膜上皮细胞用皮质醇(5,15和30ng / ml)处理0,3,12或18小时。通过QPCR提取并分析RNA。控制细胞没有任何处理;低= 5 ng / ml皮质醇;中间= 15 ng / ml皮质醇;高= 30ng / ml皮质醇。3个子宫(不同的培养细胞组)被用于分析。数据用平均值±SEM表示。*P.<0.05,**P.<0.01 VS对照组

皮质醇对Beecs细胞周期的影响

为了探讨皮质醇在控制Beec增殖方面的可能作用,我们通过流式细胞术测量细胞周期分布(图。2)。结果表明,15ng / ml皮质醇显着增加(P.< 0.05) S期细胞比例,5 ng/mL和30 ng/mL皮质醇组也表现出相似的趋势。这些数据表明,15 ng/mL的皮质醇可能通过加速细胞周期中G0/G1向S相的转变来促进BEEC的生长。

图2
图2.

皮质醇对牛子宫内膜上皮细胞细胞周期分布的影响。用皮质醇(5,15和30ng / ml)处理牛子宫内膜上皮细胞24小时。通过流式细胞术检查细胞周期分布。控制细胞没有任何处理;低= 5 ng / ml皮质醇;中间= 15 ng / ml皮质醇;高= 30ng / ml皮质醇。3个子宫(不同的培养细胞组)被用于分析。数据用平均值±SEM表示。*P.<0.05 VS对照组

皮质醇在Beecs中激活WNT /β-Catenin信号传导途径

为了确定Wnt /β-catenin信号传导途径是否参与贝ECs中的增殖,使用Western印迹分析检测信号传导途径中的关键蛋白。图2中的结果。3.A表明,β-catenin的蛋白质水平在所有时间点显着增加(P. < 0.01) with 15 ng/mL cortisol treatment, and the expression levels of c-Myc and cyclinD1 also increased (P. < 0.05) at the 15 min and 30 min time points. The levels of β-catenin, c-Myc and cyclinD1 proteins reached their peak at the 30 min time point. As shown in Fig.3.B,β-连环蛋白蛋白水平增加(P. < 0.05) in the 15 ng/mL cortisol treatment group compared with the control group. The expression of c-Myc was increased (P. < 0.05) following cortisol treatment at 5 ng/mL, 15 ng/mL, and 30 ng/mL compared to the control groups. Meanwhile, the expression of cyclinD1 was increased (P. < 0.05) following cortisol treatment at 15 ng/mL and 30 ng/mL compared to the control groups. The level of β-catenin in the cell nucleus and cytoplasm was higher in the treated group than in the control group (Fig.3.C)。

图3.
图3.

皮质醇对牛子宫内膜上皮细胞Wnt /β-catenin通路活性的影响。(一种)用皮质醇(15ng / ml)处理细胞0,15,30,45和60分钟。(B.)用皮质醇(5、15和30 ng/mL)处理细胞30分钟。通过蛋白质印迹分析测定β-catenin,C-myc和cyclind1水平。β-肌动蛋白用作内部对照。(C)用皮质醇(15ng / ml)处理细胞30分钟。通过共聚焦显微镜评估β-连环蛋白水平。3个子宫(不同的培养细胞组)被用于分析。数据用平均值±SEM表示。*P.<0.05,**P.<0.01 VS对照组

皮质醇在Beecs中激活PI3K / AKT信号通路

为研究皮质醇增殖作用的潜在机制对贝ECS,通过Western印迹分析检查PI3K / AKT信号通路的激活。

如图1所示。4.A,PI3K的磷酸化水平升高(P. < 0.01) after the 30 min cortisol treatment. Compared to that in the control groups, the phosphorylation level of AKT was elevated (P. < 0.05) after the cortisol treatment at 15, 30 and 45 min. The phosphorylation levels of PI3K and AKT reached a peak with the 15 ng/mL cortisol treatment at the 30 min time point. The results in Fig.4.b显示,不同浓度(5 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL)的皮质醇孵育后,PI3K磷酸化水平显著升高(P. < 0.05) compared with that in the control group. Compared with that in the control group, the phosphorylation level of AKT was elevated (P. < 0.05) following 5 ng/mL and 15 ng/mL treatments.

图4.
图4.

皮质醇对牛子宫内膜上皮细胞Pi3k和Akt磷酸化的影响。(一种)用皮质醇(15ng / ml)处理细胞0,15,30,45和60分钟。(B.)用皮质醇(5、15和30 ng/mL)处理细胞30分钟。Western blotting检测p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT水平。以总PI3K或AKT蛋白水平作为内对照。3个子宫(不同的培养细胞组)被用于分析。数据用平均值±SEM表示。*P.<0.05,**P.<0.01 VS对照组

讨论

皮质醇参与哺乳动物中的各种复杂的生物学效应,例如生长,免疫应答和代谢。在这项研究中,我们证明皮质醇可以促进VEGF和CTGF基因表达和活性Wnt /β-catenin和PI3K / AKT信号传导途径,这可以促进细胞增殖。

生长因子(VEGF,CTGF和TGF-β1)在增殖,分化,基质修复和重塑中发挥一些调节作用[20.37.38.].我们的研究表明,皮质醇可以上调VEGF和CTGF的mRNA水平,但TGF-β1的mRNA水平没有显着上调。虽然据报道,皮质醇通过增加抗血管生成基因的水平抑制血管生成[39.[这种特殊效果可能与细胞特异性方式和皮质醇剂量有关。伯纳贝等。据报道,皮质醇药理剂量降低了VEGF生产,而皮质醇在生理压力期间观察到的浓度下施用时可以诱导VEGF的显着增加[40].Fehrholz等人报告了类似的效果。,其中观察到糖皮质激素明显增加肺上皮细胞中CTGF mRNA水平,但在TGF-β1mRNA表达上没有检测到效果[41.].Dammeier等发现糖皮质激素诱导CTGF mRNA表达不依赖于TGF-β1 [24.].据报道,类固醇激素调节子宫内膜恢复,即组织形成和血管生成需要生长因子(VEGF,CTGF和TGF-β1)[18.],这些生长因子的表达水平在Beecs的激活修复状态下增加了[42.].因此,皮质醇可以增加VEGF和CTGF mRNA水平以促进体外贝克的增殖和生长。

Wnt/β-catenin信号通路在创面愈合的增殖阶段起着明显的作用已被广泛接受[43.].陈等。建议Wnts是子宫和胚胎植入的发展中的重要因素[44.].已经证明,Cyclind1和C-Myc分别需要转换G1 / s和G2 / m阶段[45.46.].在本研究中,我们发现在皮质醇治疗后S相的Beecs中的比例增加。它是癌细胞中的常见表型,促进G1 / S期转变可以促进癌细胞增殖[47.].这些结果表明皮质醇促进了Beec增殖。数据显示,与对照细胞相比,在30分钟的峰值达到峰值后,β-catenin,C-myc和cyclind1的水平显着增加,其明显增强了Wnt /β的激活明显增强-Catenin导致下游蛋白质的高表达。皮质醇在30分钟的处理中增加了β-catenin,C-myc和cyclind1的蛋白质水平,这可能是浓度相关的。Wnt /β-catenin途径活化与15 ng / ml皮质醇处理具有最大的效果。然而,不同浓度的皮质醇是否可以诱导不同的效果需要进一步调查。此外,在15 ng / ml皮质醇处理后,核和细胞质在核和细胞质中明显升高,这进一步证明了WNT /β-catenin信号传导途径的激活。这些结果与先前的研究一致,其在随后向细胞核倾斜的细胞质中显示累积的β-catenin以激活其靶基因[43.48.].在一起,本研究表明,皮质醇可以调节WNT /β-Catenin信号传导途径,以增加Beec增殖。

先前的研究表明,细胞增殖通过早期伤口愈合期间的细胞凋亡还原来调节[49.].PI3K / AKT途径是细胞增殖,细胞凋亡和细胞周期的重要调节因子[50.51.].证据表明,该途径与增殖性疾病密切相关,例如癌症[52.53.].我们的结果表明,在30分钟内,PI3K和AKT的磷酸化水平随15 Ng / ml皮质醇处理。此外,各种浓度的皮质醇在指定的时间点处增加了PI3K和AKT的磷酸化水平,在15ng / ml处具有峰。类似于先前的报告,糖皮质激素可以激活PI3K / AKT途径以防止细胞凋亡[54.].这些发现表明,增强了PI3K / AKT的激活,并且它参与了通过皮质醇诱导的贝的多个下游途径。但是,应进行进一步调查。

结论

本研究证明了皮质醇对牛子宫内膜上皮细胞的增殖作用。通过增加生长因子(VEGF和CTGF)的表达并激活WNT /β-catenin和PI3K / Akt信号传导途径来实现这种效果。

可用性数据和材料

在当前研究期间使用和分析的数据集可从合理的请求中获得相应的作者。

缩写

AKT:

蛋白激酶B.

Beecs:

牛子宫内膜上皮细胞

BSA:

牛血清白蛋白

CTGF:

结缔组织生长因子

DMEM-F12:

Dulbecco的改良鹰的中等和火腿的F-12营养混合物

FBS:

胎牛血清

PBS:

磷酸盐

PI3K:

磷脂酰肌醇3-激酶

PVDF:

聚乙二烯二氟化物

QPCR:

定量逆转录 - 聚合酶链反应

TGF-β1:

转化生长因子-β1

VEGF:

血管内皮生长因子

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致谢

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资金

该研究由中国国家自然科学基金(31672614; 31802253),中国博士后科学基金会(2018 M632398),江苏省自然科学基金(BK20160062),江苏高等教育机构的自然科学基金中国(17KJBB230007)是扬州大学的优秀年轻骨干教师基金会,江苏高等教育机构(PAPD)的优先学术计划发展和江苏高等教育机构的Topnotch学术课程项目(TAPP)。

作者信息

隶属关系

作者

贡献

大部分实验由JD和JL构思、设计和完成,并起草了实验手稿。JL和LC提供了有价值的讨论并修改了最终稿件。XM参与了手稿的起草,并协助讨论数据。YQ参与了实验流程和数据分析。HW构思了这个研究,参与了它的协调,并帮助修改了手稿。所有作者阅读并批准最终稿件。

通讯作者

对应到恒王

伦理宣言

伦理批准和同意参与

该议定书经扬州大学动物护理和伦理委员会批准。

同意出版物

不适用。

利益争夺

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董,J。,李,J.,Li,J.等等。皮质醇对牛子宫内膜上皮细胞的增殖作用。饲养Biol内分泌17,97(2019)。https://doi.org/10.1186/s12958-019-0544.1.

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关键词

  • 牛子宫内膜上皮细胞
  • 皮质醇
  • 生长因素
  • wnt /β-catenin
  • PI3K / AKT
  • 增殖
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