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成功妊娠后,产前诊断为携带复杂染色体重排的NGS

抽象的

背景

该研究旨在为具有复杂染色体重排(CCR)的辅助繁殖的辅助繁殖中的辅助繁殖中的生育风险预测。

方法

我们实施了一种稳健的方法,将全基因组低覆盖率配对测序(WGL-MPS)结合起来,结合跨越PCR和着床前基因非整倍体检测(PGT-A)方法,为因ccr而反复流产的夫妇的辅助生殖胚胎选择过程提供准确的染色体断点连接序列。

结果

将WGL-MPS应用于患有CCR的女性携带的CCR,其由9点和与生育风险相关的1个密码缺失组成。测序数据提供了用于设计结合跨越PCR和PGT-A的重要信息,该方法在培养的11种胚胎上进行。考虑一个胚胎有资格进行移植,其携带与雌性载体的完全相同的CCR,其表型是正常的。羊水还通过WGL-MPS和核素型在19周的妊娠,验证了婴儿携带相同CCR的结果。一个健康的婴儿出生于阴道分娩39周的妊娠。

结论(s)

我们的研究说明了WGL-MPS方法与结合跨越PCR和PGT-A的方法是一种强大而实用的方法,可以在辅助流产由于染色体异常,特别是CCR载体的辅助流产的辅助再现的一种强大而实用的方法。

背景

复杂的染色体重排(CCR)是涉及三种以上的细胞遗传学断点的结构重排[12].据估计,3.5%有复发性流产史的夫妇至少有一方携带染色体结构重排[3.].最常见的这些重新排列是易位。其他重排包括反转,插入,缺失,重复,或者很少,环染色体[4].CCRS载体的配子中染色体不平衡的潜在风险高于简单易位的风险,从而有助于反复流产的风险更高5].CCR家族中自发堕胎和妊娠异常结果的发病率分别为48.3和53.7%[6].来自CCR载体的近18.4%的所有活产患者导致表型异常后代,所有CCR载体的一半产生后代也是CCR载体的[6].此外,ccr的复杂性越高配子产生不平衡的风险就越高,因此后代受影响的风险也就越高[78].为了评估CCRS载体面临的风险,他们尽可能准确地考虑妊娠,CCR的精确表征至关重要。

几种细胞遗传学和分子方法如Giemsa条带,荧光原位杂交(鱼),阵列 - 比较基因组杂交和阵列涂料已经应用于研究与异常表型相关的染色体结构变化[9].然而,这些技术缺乏在核苷酸水平上定义重排所需的精确性,可能无法识别较小的染色体复制和缺失,而且往往在技术上具有挑战性和耗时[101112].

近年来,一种通过全基因组低覆盖率配对测序(WGL-MPS)全面检测平衡染色体重排的稳健方法被开发出来用于ccr的详细调查[13].该方法可以识别几乎所有的隐性染色体异常或复杂的重排存在于基因组。此外,它能够在核苷酸水平上表征易位断点[12131415].因此,通过全面测绘CCR并为后续PGT-A提供精确的断点序列,该方法提供具有生殖问题的伴侣的产前遗传咨询的价值。

方法

案例介绍

一对年轻夫妇(男女年龄分别为27岁和30岁)连续经历了两次早期自然流产。不孕的原因尚不清楚。采用常规方法对培养的淋巴细胞g显带中期扩散进行核型分析。该男性的核型是正常的46,XY,而该女性携带复杂的染色体重排:4号染色体的q25q28片段被插入到1号染色体的q22中,该4号染色体与5号染色体平衡移动。断裂点分别在4q31.1和1q22。她的核型(无花果。1)是:

图。1
图1

母体和胎儿核型。(一个)母亲核型。(b)19周的胎儿羊水酸核型。它们的核型是46,xx,der(1)t(1:4)(p22:q31.1),der(4)INS(5:4)(Q22; Q25Q28)T(1:4),der(5)INS(5:4)

46,XX,DER(1)T(1:4)(P22:Q31.1),DER(4)INS(5:4)(Q22; Q25Q28)T(1:4),DER(5)INS(5:4)。

WGL-MPS分析和断点验证

根据核型分析的结果,她对她来说,通过天然怀孕生育正常的孩子,她面临着受影响的后代的风险增加。

为了确定断点的确切位置,并了解更多关于异常妊娠结局的风险,对该妇女进行了WGL-MPS手术。用Qiagen DNA提取试剂盒从患者外周血中提取基因组DNA,构建非大小的选择配对文库[12[然后通过BGISEQ-500进行50-BP-END复用测序。除去包含测序适配器和低质量读取的读取后,使用SOAP2对准NCBI人参考基因组(HG19,GRCH37.1)对准。随后唯一映射的读取仍然仍然留下了如前所述的后续分析[1315].如前所述,通过连接跨越PCR验证了这些断点[9].PCR引物保留充分。

非倍性的遗传学试验

该女性使用了长协议,或GNRH(促性腺激素释放激素)拮抗剂方案用于受控卵巢过度刺激。在HCG注射后检索卵母细胞34至35小时,用血管科生物注射液(ICSI)施用。我们通过两个循环获得了20个鸡蛋,并且成功受精了15个鸡蛋,并最终发育成胚泡。如yanagimachi r,等,按照yanagimachi r等,进行卵巢刺激,卵母细胞检索和胚胎培养16].从囊胚中获得的滋养层细胞如Jian Ou等所述[17],用G-MOPS (Vitrolife)培养基冲洗3次,用最小培养基转入无rna - dna - PCR管(Axygen)中使用QIAGEN试剂盒进行全基因组扩增(WGA)。扩增产物在-20℃下储存。为避免污染,这一过程应该全部在通风柜中处理。对断裂点验证在扩增产物上进行,通过预先保持PCR引物对,并且仅保留了仅三个胚胎(包括遗传有9个断点和一个没有断点的胚胎的两个胚胎)进行进一步分析。PGT-A通过在这三个胚胎上进行全面的染色体筛选来完成[17].胚胎被发现是平衡整倍体和可转移的。经过基因咨询后,这对夫妇决定进行植入手术。胚胎移植后14天检测HCG水平。超声检查胎儿心跳证实妊娠。在妊娠19周时进行羊膜穿刺术以确认产前诊断。

结果

在这项研究中,我们向诊断患有非常复杂的染色体重排的女性呈现了一个独特的案例,其相应的断点精确地通过WGL-MPS识别。我们使用结跨PCR来验证辅助再现期间产生的胚胎的相应断裂点,并通过常规PGT-A进一步检查非整倍性。在仔细咨询和获取这对夫妇的同意之后,我们将筛选的合格胚胎和具有相同CCR的正常表型宝宝作为其母亲出生。在这里,我们描述了这种方法(图。2)。

图2
图2.

实验操作流程图。首先,我们利用WGL-MPS技术检测母体染色体中的ccr。其次,我们利用PCR方法对11个卵母细胞序列验证产生的胚胎的相应断点进行了验证。第三,我们对选定的3个胚胎进行PGT-A检测,最终获得与母亲相同的ccr胚胎。最后,我们移植了一个经过筛选的合格胚胎和一个与母亲出生时具有相同ccr的正常表型婴儿

频段分辨率的G型分析结果显示,该女子为3条染色体平衡易位的携带者,两条断点分别位于4q31.1和1p22。然而,WGL-MPS分析显示了更为复杂的重排。综上所述,在1号染色体上发现了9个断点和一个微缺失,如图所示。3..使用新的命名法用于Ordulu提出的测序断点[18[因此修订了染色体易位的公式作为:

图3.
图3.

根据HG19的说法,重新组装涉及易位的染色体区域(www.genome.ucsc.edu.

46,XX,DER(1)INS(1; 4)(1; 4,> 1P31.1(5Q23.3 :: 1P31.2)4Q28.3-> 4时),der(4)T(4:1)。

(4 pt - > 4 q31.1:: 1 p28.3 - > 1 pt),火线(5)ins (5) (5 pt - > 5 q23.3 (t (4,1) (4 q28.3(发票(1)

(p31.3 :: p31.2)inv。(1)(p31.2 :: p31.1))5q23.3-> 5时)。

在我们的研究中,有四个基因,包括C1ORF141,IL23R,MIER1,SLC35D1在1P31.3删除时被删除。这IL23R基因提供了制造一种叫做白细胞介素23 (IL-23)受体的蛋白质的指令。序列的变化IL23R基因也与其他几种免疫系统相关条件的风险有关,如牛皮癣和炎症性肠病。SLC35D1是核苷酸糖转运蛋白,其定位于内质网,并运于UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰基半乳糖胺。纯合和复合杂合损失SLC35D1在Schneckenbecken发育不良患者中有突变的报道。在1号染色体上PRKACB编码camp依赖蛋白激酶(PKA)催化亚基的基因在第7个断点被中断。在4号染色体上SLC7A11.基因在第二个断点中断。5号染色体上FBN2.SLC27A6在第8个断点处中断。这FBN2.编码一种称为Fibrillin-2的大蛋白质的基因在OMIM中注释,与常染色体显性先天性合约术和早发黄斑变性相关联。幸运的是,这位女士不受第8个断点的影响,可能是因为断点靠近结尾FBN2.基因序列。没有其他已知的基因被剩下的断点(断点1、断点5、断点6和断点9)打断。

根据断裂点的侧翼序列设计八对引物。底漆的序列显示在表中1.如果正确地预测了断点位置和序列,则如图4所示。3.并且引物有效,扩增产物的相应条带应呈现在电泳图上。

表1断点的底漆信息

11个胚胎滋养层细胞的WGA产物进行了断点分析,使用PCR引物对扩增连接序列,3个胚胎(包括2个遗传了9个断点的胚胎和1个没有断点的胚胎)进行了PGT-A协议。PGT-A显示胚胎4为chr16三倍体,胚胎9有6q16.1(9310万- 9950万)缺失(表2)。鉴定为母亲植入母亲的单倍体胚胎,以携带所有相同的九个断点。羊膜穿刺术和WGL-MPS的产前诊断在19周的妊娠上进行,胎儿揭示了胎儿是相同复杂的染色体重排和作为母亲的缺失的载体。通过阴道分娩39周的妊娠,在妊娠39周的妊娠时送达健康的2780克婴儿。

表2胚胎筛选结果

讨论

以前已经证明,在未受影响的个体中,明显平衡的ccr的精确特征是至关重要的,因为它们可能产生配子与不平衡的产物,因为在减数分裂期间,四价形成,这通常导致繁殖失败,反复流产或受影响的后代[20.21].

在本研究中,我们提出一个罕见的案例,无影响的女性经历复发流产与ccr。核型分析结果表明1号染色体和4号染色体之间存在平衡翻译,4号染色体q25q28片段插入5q22染色体。然而,本研究中使用的WGL-MPS可以精确重建衍生染色体,有趣的是,它显示了一个更为复杂的重排图,其中1号染色体的三个片段、4号染色体的一个片段和5号染色体的一个片段发生易位。以前有研究表明,隐性缺失是染色体“平衡的”相互重排和复杂的染色体重排的常见发现,这可以解释许多病例的临床表型[20.].这种情况下的女人携带CCR,已经经历过两次流产。由于她的CCR高度,她可能会通过天然怀孕生育正常的孩子,并且她面临着受影响的后代的风险增加。在与她的医生咨询后,这对夫妇决定经过援助再生法。由于CCR,在移植前需要准确地确定断裂点,并且不需要保持不具有断点或携带母亲的断裂点的胚胎。在上述筛选中保留的胚胎应通过PGT-A测试以筛选染色体结构异常和数量的那些。如果这个女人和她的孩子在未来繁殖,他们需要辅助再现,并进行上述相应的测试,以筛选适当的胚胎。我们的病例证明,WGL-MPS方法与结跨的PCR和PGT-A相结合,可以是风险评估和胚胎选择的强大而实用的工具,对于由于染色体异常,具有复发的流产的伴侣。

断点的精确识别是细胞遗传学中最有趣和技术上具有挑战性的领域之一,用于研究染色体重排的载体的可能基因型和表型结果。已经采用常规技术,例如用荧光染料标记的细菌人工染色体克隆和DNA阵列杂交与染色体分选相结合的常规技术,以表征磷酸染色体分接点对千碱基水平[22232425].然而,这些技术既费力又昂贵。近年来,大规模的并行测序已经发展成为准确检测断点的技术,但这种技术高度依赖于受影响的g带区域的先验知识。在我们的研究中,我们开发了一种实用的解决方案,可以快速定位到单个基因的隐性断点,大幅提高生育风险和表型结果的预测,并在允许临床行动的时间框架内及时通知产前医疗保健。此外,我们的方法可以精确地识别到核苷酸水平的断点,可以更好地评估染色体异常的基因型和表型后果。

结论

准确的断点映射是为携带CCR的夫妻提供生育风险,遗传咨询和生育指导的关键。在该研究中,稳健的方法,全基因组低覆盖伴侣对测序(WGL-MPS)被施加到雌性CCR载体上,而不利用G带的结果,精确地揭示了9个断点和1个密码缺失与生育风险有关,并为PGT-A过程提供了重要信息。在培养的11个胚胎上进行结跨的PCR和PGT-A,认为只有一个胚胎被认为具有与雌性载体恰好相同的CCR,其表型正常。通过WGL-MPS研究了羊水,验证了婴儿携带相同的CCR。一个健康的婴儿在39周的妊娠通过阴道分娩时送达。我们的研究说明了WGL-MPS方法,尤其是结合结合的PCR和PGT-A是具有复杂染色体异常和复发流产的夫妻辅助再现的有价值的工具。

可用性数据和材料

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。

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下载参考

致谢

作者感谢南京医科大学附属苏州医院,提供样品和道德批准和技术 - Cheerland精密医学研究所提供研究设备。

资金

本研究由苏州市产业技术创新项目(SYS201566)、江苏省“十三五”青年医疗人计划(QNRC2016246)和深圳市大鹏新区科技创新与产业发展专项基金(YL201800201)资助。

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ou,J.,Yang,C.,Cui,X.等等。NGS对复杂染色体重排的载体进行产前诊断后的成功怀孕。饲养Biol内分泌18,15(2020)。https://doi.org/10.1186/s12958-020-00572-5

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关键词

  • 复杂的染色体重排
  • 断点映射
  • 全基因组低覆盖伴侣对测序
  • 非倍性的遗传学试验
  • Junction-spanning PCR