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鸢尾素对植入失败大鼠LIF和整合素αvβ3的影响

摘要

客观的

本研究旨在探讨鸢尾素对着床失败子宫白血病抑制因子(LIF)和整合素αvβ3的影响。

方法

妊娠早期大鼠随机分为正常组(N)、米非司酮治疗组(M)、鸢尾素组(I)、黄体酮组(P)。其次,我们评估平均胚胎数,并检测子宫内膜LIF和整合素αvβ3蛋白及mRNA的表达。

结果

与M组比较,N、P、I组平均胚胎数显著升高,N、P、I组子宫内膜LIF和整合素αvβ3的表达显著升高。

结论

鸢尾素可通过促进子宫内膜LIF和整合素αvβ3分泌改善植入失败大鼠的胚泡植入,改善子宫内膜不良的接受状态。

背景

鸢尾素是一种新发现的肌激素,运动后立即从肌肉中释放。它是由包含5 (FNDC5)的纤连蛋白III型结构域在其细胞外蛋白裂解后分泌的[1].它驱动棕色脂肪样转化的白色脂肪组织(Wat),因此已经提出改善代谢和葡萄糖稳态[2].自发现以来,由于其生理病理作用,鸢尾素一直是许多研究的主题。鸢尾素最初被描述为防止饮食诱导的体重增加的保护因素,通过WAT的褐变,从而增加能量消耗[3.].许多随后的研究已经研究了代谢性疾病的潜在作用,包括肥胖、2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、脂质代谢和心血管疾病(CVD)、多囊卵巢综合征(PCOS)和代谢性骨病[4].然而,这种激素的生殖影响,如果有的话,在很大程度上仍未被探索。

生殖能力与脂肪组织的代谢状况密切相关,肥胖和营养不良均被发现与生殖功能障碍有关[56].现有证据表明,瘦素、胰岛素和脂联素等主要功能是调节能量代谢的生物因子在生殖中的作用是确凿的[78].研究表明,鸢尾素在子宫内膜和卵巢中均有表达[910].基于这些研究,我们推测鸢尾素作为一种新的代谢紊乱的分子标记和靶点[11,可能对生殖能力有潜在影响。由于接受性子宫内膜是成功妊娠早期植入的关键[12],本研究旨在探讨鸢尾素对子宫着陆点子宫内膜容受性标志物白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)和整合素αvβ3表达的影响。

材料和方法

动物和分组

性成熟的女性Wistar大鼠(n= 64),重量210-230克,生殖成年男性Wistar大鼠(n= 32),重量250-300克,SPF等级,由湖北医学院医学实验动物中心提供。所有大鼠都自适应喂养3天。观察到雌性大鼠的雌激素循环,并在下午6点与雄性大鼠旋转雌性大鼠,并在第二天八点检查剧痛涂片。怀孕的第一天(D1)被定义为阴道涂片上的精子检测。然后随机将孕鼠划分为正常组(n,n= 16)和植入失败组(n= 48)。

建模和治疗

米非司酮片(青岛洁仕康生物科技有限公司)中国)溶解在适量的食用香油中,最终浓度为2 mg/ml。植入失败组大鼠于早上9点D1颈部皮下注射米非司酮溶液5.5 mg/kg建立植入失败模型,N组大鼠给予等量麻油。将植入失败大鼠随机分为米非司酮治疗组(M组、n= 16)、鸢尾素组(I组,n =16)和黄体酮组(P组,n =16)。

I组和P组大鼠分别皮下注射重组鸢尾素(北京百奥来博科技有限公司)。中国;100 ng/g.d)和黄体酮(浙江仙居药业有限公司;从D1到D6, M组和N组同时注射等量生理盐水。然后将各组大鼠随机分为6天妊娠组和10天妊娠组(分别定义为N6与N10、M6与M10、I6与I10、P6与P10;n=所有组8)。妊娠6 d组大鼠于妊娠第6天注射后处死,妊娠10 d组大鼠饲养至妊娠第10天处死。

组织处理

各组大鼠于D6、D10日下午4时腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉。剖腹取子宫,计数妊娠10 d大鼠胎数。在解剖镜下剪断孕6天大鼠子宫。收集囊胚附着的子宫内膜,4%多聚甲醛固定部分子宫内膜,石蜡包埋,切片;而另一些则保存在−80℃下以备后用。

组织学参数

固定子宫组织,切取5 μm厚的切片,按标准程序苏木精伊红染色。用显微图像观察子宫内膜形态。

LIF和整合素αvβ3的免疫组化

石蜡切片在60°C的烤箱中保存1小时。然后用降解的乙醇对这些切片进行脱亲和再水合。将切片置于0.01 M柠檬酸缓冲液(PH 6.0)中,98°C孵育20 min,提取抗原。然后用3% H猝灭内源过氧化物酶活性2O2.将切片用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭30分钟。耗尽过量的BSA。然后将这些部分在相应的一抗在4℃下孵育过夜。兔(振温生物科技有限公司)饲养抗LIF和整合蛋白αvβ3的原发性抗体。对于阴性对照,将载玻片孵育在PBS中。然后将这些切片与HRP标记的山羊抗兔IgG一起温育1小时,并与底物二苯甲胺孵育3-5分钟并用Harris苏木精染色。尼康微观成像系统仅在40倍的光学显微镜下,每片10个字段,并用Image-Pro加6.0分析,测量平均光学强度(AOI)。

ELISA for LIF和整合素αvβ3

将子宫切碎匀浆,提取总蛋白,用BCA法检测蛋白含量。将样品稀释至1 ~ 10μg/ml,取100ul样品进行Elisa检测。定量三明治酶免疫分析技术的程序遵循制造商的方案(库萨比奥生物技术有限公司。中国)。

Real-time PCR检测LIF和整合素αvβ3

用Trizol试剂(Takara Biotechnology Co., Ltd.)解离子宫。(中国),总RNA提取按照制造商的方案。用核酸/蛋白分析仪测定RNA纯度和浓度。取提取的总RNA 1μg,用逆转录试剂盒按照制造商的协议(Takara Biotechnology Co., Ltd.)进行逆转录。中国)Mastercycler梯度PCR仪。根据已发表的序列设计引物。然后取50ul反应体系进行PCR扩增。Real-time PCR反应采用Applied Biosystems Step-One Real-time PCR系统,热循环方案:第1阶段,Reps1 95°C 30 s;第2阶段,Reps40 95°C 5秒,60°C 30秒;阶段3,Reps1 95°C 15秒,60°C 1分钟,95°C 15秒。 The data were analyzed by the 2−ΔΔCT方法。

底漆序列:

β-肌动蛋白。

正向引物:5“-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3”。

反向引物:5“-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3”。

生活

正向引物:5“-ATCAAGAGTCAACTGGCTCAACTCA-3”。

反向引物:5’- TGTTGGGCGCACATAGCTTAT-3’。

整合素αvβ3。

正向引物:5“-TTCAATGCCACCTGCCTCAA-3”。

反向底漆:5'-TGAAGCTCACCGTGTCTCCAA-3'。

统计分析

数据以均数±标准差(SD)表示。采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。两组间差异采用独立t检验,多组比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间定性资料比较采用卡方检验。所有p-值< 0.05被认为具有统计学意义。

结果

大鼠子宫胚胎植入

检查子宫内植入胚胎的数量和形态状况。(表1,无花果。12).

表1妊娠率及平均植入胚胎数(±S)
图1
图1

大鼠子宫外观

图2
figure2

在光学显微镜下观察的形态变化(原始放大率:×40)

M组子宫颜色苍白,着床部位分布不对称,胚胎大小较小,宫腔未闭合。N组、P组和I组子宫呈鲜红色,着床部位分布对称,胚胎丰富,宫腔封闭。

M组平均植入胚胎数明显低于N组(p然而,与群体组相比,I族和群P组中胚胎中胚胎的平均数量明显增加(p= 0.002,p分别为= 0.001)。P组、N组、I组差异无统计学意义(p= 0.931)。

Elisa结果

M组子宫内膜LIF和整合素αvβ3蛋白水平明显低于N组p< 0.001),而与M组相比,I组和P组的LIF和整合素αvβ3蛋白水平明显升高(p <0.001对)。P组、N组、I组差异无统计学意义(LIF:p= 0.144;整合素αvβ3:p= 0.229)。(表2).

表2子宫内膜细胞因子蛋白浓度Elisa比较(±S)

结果免疫组织化学

如图所示。3.,子宫内膜LIF蛋白主要表达于间充质细胞,而整合素αvβ3蛋白主要表达于腔上皮和腺上皮。与N组相比,M组LIF和整合素αvβ3的AOI明显降低p< 0.001);与M组比较,I组和P组LIF和整合素αvβ3的AOI明显升高(p< 0.001)。P组、N组、I组差异无统计学意义(LIF:p= 0.090;整合素αvβ3:p= 0.297)。(表3.,无花果。3.).

图3
图3

免疫组化染色(原放大倍数:× 400)

表3子宫内膜细胞因子蛋白免疫组化平均光强度比较(±S)

rt - pcr结果

与N组比较,M组子宫内膜LIF和整合素αvβ 3mrna表达明显降低p< 0.001);而与M组相比,I组和P组的LIF和整合素αvβ3 mRNA表达显著升高(p <0.001对)。P组、N组、I组差异无统计学意义(LIF:p= 0.090;整合素αvβ3:p= 0.297)。(表4).

表4子宫内膜细胞因子mRNA浓度RT-PCR比较(±S)

讨论

着床是生殖过程中最重要的过程之一,是妊娠成功的关键。在这个过程中,充满活力的胚泡和接受性子宫内膜是成功植入的两个先决条件。子宫内膜容受性是指子宫内膜上皮细胞在结构和功能上为胚胎着床做好准备的状态。卵巢激素及其受体、整合素αvβ3、LIF等已被认为是子宫内膜容受性的标志物。

我们知道米非司酮是一种典型的黄体酮拮抗剂它会阻断黄体酮的作用并抵抗植入[13].这些众所周知的子宫内膜容受性标志物,如LIF、整合素αvβ3,都具有相同的特征,即它们都可以直接或间接地受到孕酮的调控[14].因此,米非司酮可破坏子宫内膜容受性,抑制囊胚着床。而在我们的研究中,米非司酮显著减少了植入囊胚的数量,并导致子宫内膜LIF和整合素αvβ3水平下降,这表明我们成功地利用米非司酮建立了植入失败模型。这为进一步观察鸢尾素对子宫内膜的作用提供了依据。

鸢尾素在医学生物学领域获得了显著的洞察力,并在代谢性疾病中具有潜在的治疗重要性。尽管如此,探索鸢尾素在其他病理/生理条件中的作用还是很重要的。

研究表明,在子宫内膜中发现鸢尾素的表达,PCOS患者子宫内膜鸢尾素水平下降[910这表明鸢尾素可能直接作用于子宫内膜。胚胎着床是妊娠成功的前提,及时对子宫内膜进行修饰,使其能够接受发育中的胚胎,是着床成功的关键[12].因此,观察鸢尾素对子宫内膜容受性的影响,对探索其生殖效应具有重要意义。

本研究表明,鸢尾素组子宫内膜植入囊胚的平均数量明显高于米非司酮组,且鸢尾素能改善米非司酮引起的LIF和整合素αvβ3的降低,证实了鸢尾素对子宫内膜接受度的潜在作用。据我们所知,关于鸢尾素对子宫内膜功能影响的研究报道很少。我们的新发现为探索鸢尾素的生殖作用提供了重要信息,同时也为不孕症的诊断和治疗提供了新的靶点。然而,这一作用在子宫内膜中可能的分子机制还没有确切的证据。目前对潜在途径的研究可能的解释是鸢尾素调节体内和子宫的能量代谢。

生殖和生育能力与能量代谢和脂肪组织的内分泌功能密切相关[56].适度的体力活动有利于生殖功能[15].研究强调了子宫内膜在肥胖女性不良生殖结果的病理生理学中的作用[161718].更具体地说,Bellver等人发表了一项针对9587例首次捐卵周期的临床研究,结果显示,随着BMI(身体质量指数)的增加,植入、妊娠和活产都显著降低。有人认为,女性肥胖可能由于接受能力降低而影响捐献卵子的生殖结果[19].Bellver等人也发表了一篇综述,支持子宫内膜在肥胖女性生殖病理生理学中的作用[20.].此外,有报道称,肥胖和高脂肪饮食损害子宫内膜基质细胞蜕膜化,而蜕膜化是子宫容受性所必需的[21].此外,有研究指出,高浓度胰岛素可抑制整合素、骨桥蛋白等子宫内膜容受性标志物的表达[2223].人们认为,子宫和胎儿之间有效的营养物质交换,包括糖原、蛋白质和脂质,是成功怀孕的必要条件[24].在着床早期,胚胎通过子宫内膜腺分泌的营养子宫内膜分泌物来滋养,这些分泌物在调节子宫内膜容受性中起着重要作用[242526].此外,主要功能是调节能量代谢的激素,例如瘦素,涉及生殖功能,更准确地说,在植入时的胚胎 - 母体串扰中[27].基于这些研究,我们可以合理地推测,鸢尾素作为一种以调节能量代谢、改善胰岛素抵抗为主要功能的激素,可能通过调节子宫的系统代谢和局部营养代谢,在子宫内膜容受性中发挥重要作用。我们的研究表明,鸢尾素可能在肥胖、PCOS等代谢性疾病合并不孕症中起主要作用,它在调节代谢异常的同时改善子宫内膜容受性,优于孕酮只改善子宫内膜功能。本研究为肥胖、多囊卵巢综合征合并不孕患者的治疗提供了一个新的视角。

此外,体力活动被认为对试图怀孕的女性有好处,特别是那些BMI较高的女性,但具体的机制令人困惑[15].由于鸢尾素增加了能量代谢,改善了子宫内膜的功能,我们可以大胆的假设,即在增加鸢尾素的释放后,体育活动可以有效的改善机体的代谢和生殖紊乱。这为女性特别是BMI较高的女性通过体育锻炼改善生殖功能提供了科学依据。

结论

本研究表明鸢尾素可以通过促进LIF和整合素αvβ3的分泌来改善着床失败子宫的不良接受状态,从而改善囊胚着床。未来的研究将证实我们的初步观察并探索可能的途径。

数据和材料的可用性

本研究中使用和分析的数据集可从通讯作者处获得。

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确认

一个也没有。

资金

本研究由湖北省教育厅科研基金(B2018437)和十堰市科研基金(18Y08,19Y94)资助。

作者信息

从属关系

作者

贡献

李成刚和周莉构思、设计并完成了大部分实验,并起草了手稿。周立和刘向书对终稿进行了有价值的讨论和修改。张涛参与了实验流程和数据分析。所有作者阅读并批准最终稿件。

相应的作者

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道德声明

伦理批准并同意参与

湖北医学院动物科研伦理委员会批准了该研究方案(批准号2018 - 87)。我们声明遵循了“实验动物护理原则”(NIH出版物第86-23号,1985年修订)以及适用的具体国家法律。

相互竞争的利益

作者声明没有竞争财务。

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周磊,李超,刘晓。et al。鸢尾素对植入失败大鼠LIF和整合素αvβ3的影响。天线转换开关性杂志19日,18(2021)。https://doi.org/10.1186/s12958-021-00700-9

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