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Irisin缺失诱导小鼠的生长和生育率降低

抽象的

背景

从纤连蛋白含有III型域域蛋白5切割的铱(Fndc5),在能量稳态中起着重要作用。能量代谢与繁殖之间的联系是众所周知的。然而,伊雷汀在繁殖中的生物学作用仍然很大程度上是未开发的。

方法

在本研究中,我们生成Fndc5产生鸢尾素缺陷小鼠的基因突变。雌性野生型(WT)和Fndc5突变小鼠以标准饲料喂养48周。首先,对小鼠的存活率、体重和生育能力进行了描述。其次,采用ELISA法测定血清类固醇激素水平,阴道涂片和卵巢连续切片测定发情周期和卵泡外观。第三,利用mrna测序分析比较卵巢与卵巢之间的基因表达Fndc5突变小鼠和wt小鼠的小鼠。最后,在KGN细胞中研究了外源虹膜对类固醇激素产生的影响。

结果

缺乏鸢尾素的小鼠死亡率增加,体重减轻,生育能力差。性激素分析显示雌二醇、促卵泡激素和黄体生成素水平下降,而黄体酮水平升高Fndc5突变的老鼠。缺乏鸢尾素的小鼠与不规则发情、窦卵泡比例降低有关。的表达式Akr1c18,Mamld1,CYP19A1这种激素参与类固醇激素的合成,在突变小鼠的卵巢中减少。外源鸢尾素能促进表达Akr1c18,Mamld1,CYP19A1在KGN细胞中,刺激雌二醇产生并抑制孕酮分泌。

结论

鸢尾素缺乏与小鼠内分泌代谢紊乱有关。鸢尾素缺乏的小鼠生长发育不良,生育能力下降。iRisin可能对表达有影响Akr1c18,Mamld1CYP19A1在卵巢中,调节类固醇激素的产生。这项研究为鸢尾素在哺乳动物生长和繁殖中的潜在作用提供了新的见解。

介绍

生殖和生育能力与能量代谢和脂肪组织的内分泌功能紧密相关,因为肥胖和重量不足都与男性和女性的不孕症相关[1]。大多数哺乳动物和硬骨鱼的摄食相关肽都与能量平衡和生殖的调节有关[2]。2012年,Bostrom等人首次将鸢尾素确定为肌激素。他们证明鸢尾素是由跨膜受体的蛋白水解过程产生的。含纤连蛋白结构域蛋白5 (Fndc5)是一个209位残基的蛋白,n端29位残基的信号序列后面有鸢尾素或推测的纤维连接蛋白III结构域、一个连接肽、一个跨膜结构域和一个39位残基的细胞质段。连接肽区域的分裂释放可溶性鸢尾素到细胞外环境[3.]。Irisin在小鼠和人类之间是100%相同的,能够刺激脂肪细胞褐变和生热,这表明能量消耗和Irisin之间有很强的关系[3.]。鸢尾素分泌于骨骼肌、皮下组织、内脏脂肪组织、肝脏、大脑、睾丸等[4,5,6]。然而,最近的研究表明,卵巢和子宫内膜也能够产生鸢尾素[7]。

最近的数据表明鸢尾素和性激素代谢之间存在联系。在罗非鱼垂体细胞的原代培养中,鸢尾素在体内和体外都能有效地刺激hl β和FSHβ mRNA的表达[8]。外源给予Irisin在肥胖女性小鼠中显着刺激LH水平[9]。铱还可以刺激颗粒细胞以产生雌二醇[10]。然而,鸢尾素对性激素代谢的可能影响仍存在争议。一些研究表明鸢尾素对下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴有负面影响。在雄性大鼠中,鸢尾素通过抑制黄体生成素和卵泡刺激素分泌来降低睾酮水平[11,12]。鸢尾素对性激素的一些影响已经为人所知,但其对生殖的影响在很大程度上仍未被探索。在人类中,全身鸢尾素水平大约在青春期开始时增加[13并在怀孕期间显著增加[14]。这些结果加强了鸢尾素影响HPG轴和调节生殖功能的假说。迄今为止,鸢尾素在雌性中的生殖功能尚未被研究。在本研究中,我们分析了雌性小鼠鸢尾素缺乏的表型和分子特征。

材料和方法

本研究由中国四川大学中国第二大学医院伦理委员会批准。

试剂

抗体Fndc5CYP19A1从Abcam (Cambridge, MA, USA)获得。抗体Akr1c18购买自品牌R&D Systems Bio-Techne (Minneapolis, MN, USA)。抗体Mamld1购自Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)。抗ERK、p-ERK、P38、p-P38的抗体购自Cell Signaling Technology (Waltham, MA, USA)。抗体GAPDH,β肌动蛋白酶标二抗购自中国四川禅宗生物科技有限公司。雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(T)、促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自中国武汉Elab-science公司。生长激素(GH)和胰岛素样生长因子I (IGF-1) ELISA试剂盒购自中国武汉库萨比奥。Wright染色源自Solarbio公司(中国北京)。此外,DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素购自Gibco (Grand Island, NY, USA)。

细胞培养

将卵巢颗粒(KGN)细胞系的冷冻股,并将细胞镀在10厘米的菜肴(1×10 ^ 6个细胞/板)中。然后将细胞在补充有10%FBS(Gibco),100个单位/ ml青霉素和100μg/ ml链霉素的DMEM / F12培养基(Gibco,Grand,Ny,USA)中培养,在37℃下在5%的气氛中CO.2。分为四组:培养基(对照)和鸢尾素10、20、30 nM培养基。培养48h后,收集细胞进行qRT-PCR和Western blotting。

Irisin不足的老鼠

铱由纤连蛋白含III型域域蛋白5(Fndc5)。在这项研究中,Fndc5通过突变产生鸢尾素缺陷小鼠。C57BL / 6Fndc5-杂合子(+/−)雌性小鼠由View固体生物技术公司(北京,中国)生产。采用转录激活子样效应核酸酶(TALEN)技术对编码靶基因外显子的DNA进行剪切。Fndc5有6个外显子,鸢尾素的编码基因位于第3外显子。剪切第3外显子的第18和第19个核苷酸导致移码突变,从而导致小鼠鸢尾素缺乏(图。1a、b)。Fndc5- 用C57BL / 6培养母生生成(+/-)雌性小鼠Fndc5-wildtype (+/+) (WT)雄性小鼠(Dossy, Chengdu,中国)产生杂合子(+/−)雄性小鼠。随后,女Fndc5不足(−−)老鼠(图。1C)通过与杂合(+/-)雄性小鼠交配杂合(+/-)雌性小鼠制备。对尾基因组DNA进行基于PCR的基因分型分析Fndc5使用引物:5 ' -CATGTTTCCTTAGCTCTACTGTG-3 '(正向)和5 ' - ggagaaagcatgcatggcagttt -3 '(反向)。实验组中有51只突变型小鼠,对照组中有44只野生型小鼠。每笼4 - 5只小鼠被关在一个温度控制的环境中,进行12小时的光/暗循环。所有的动物都得到了食物(Dossy company,成都,中国)和水。为了研究鸢尾素对生长和生殖的影响,我们比较了20周龄两组小鼠卵巢形态、动情周期和循环激素水平。此外,我们记录了小鼠从出生到48周的死亡率、体重和产仔率。

图1
图1

一代的Fndc5突变的老鼠。a:基因靶向程序示意图。黑色箭头表示目标外显子。b:序列Fndc5小鼠中的mRNA转录物和预测的蛋白质被各自的mRNA编码。C:确认Fndc5突变。基因分型(左图)和Western blot(右图)分析结果一致Fndc5突变

纯化重组Irisin的表达与表征

在本研究中,重组鸢尾素由大肠杆菌。鸢尾素的表达和纯化与之前报道的一致,略有修改[15]。我们使用了pET28M向量而不是pET28a+向量。鸢尾素能刺激3t3 - l1细胞系中p38和ERK蛋白的磷酸化。3 T3-L1细胞(Bioleaf、上海、中国)与完整的DMEM培养(美国纽约Gibco,大岛)补充10%胎牛血清(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(热费希尔科学)为37.0°C在湿润的气氛中95%的空气和5%的二氧化碳。简单地说,3个T3-L1细胞以2 × 10的密度培养5用重组r-鸢尾素或PBS(对照)处理5、10、20或30分钟。然后,收集细胞进行Western blotting。如图所示。6,磷酸化p38 (P-p38)和磷酸化ERK (P-ERK)水平显著增加早在5分钟,10至20分钟达到高峰,并降低了30分钟3 T3-L1 irisin治疗后细胞,而总p38、ERK和GAPDH蛋白质含量没有显著差异在不同的时间。结果表明,鸢尾素可以激活下游信号通路发挥生物活性。

核糖核酸测序分析

mRNA-seq实验由Novogene公司(中国北京)进行。构建了用于测序的mRNA-seq文库。简单地说,用TRIzol试剂(Invitrogen)从野生型或突变型小鼠卵巢、肌肉或下丘脑中分离总RNA,用RNase-free DNase I (New England Biolabs, MA, USA)处理以去除任何污染的基因组DNA。用聚t寡聚磁珠(Invitrogen Dynal)从总RNA中纯化mRNA。利用上标II逆转录酶(Invitrogen)和随机六聚体引物合成了双链互补dna。然后,通过雾化将这些dna碎片化,然后按照标准的Illumina协议创建mRNA-seq库。对于数据分析,使用CASAVA进行基本调用。使用带有默认参数的拆分读取对准器TopHat和Bowtie2将Reads与基因组进行对齐。利用HTSeq估算丰度。

实时定量PCR (qRT-PCR)

用细胞总RNA分离试剂盒(Fore Gene, Inc.)分离总RNA。然后使用RT EasyTM II (Fore基因,Inc.,成都,中国)根据制造商说明书进行cDNA合成。qPCR采用PCR Easy TM试剂盒(Fore Gene, Inc.,中国成都)和Applied Biosystems公司7500 Real-Time PCR系统,在以下条件下进行:95°C 3 min,然后在95°C 15 s和60°C 30 s的条件下进行40次循环。此外,比较2——ΔΔCT方法对基因表达进行分析。GAPDH作为内源内参基因。引物由引物3生成,列于表中1。同时,qRT-PCR检测3个重复。

表1 qRT-PCR的相关参数

Western Blot.

用PBS洗涤卵巢组织和KGN细胞,收获并使用RIPA裂解缓冲液(Beyotime Inst Biotech, Shanghai, China)裂解。根据制造商的说明,使用bicinchoninic酸(BCA)蛋白检测试剂盒(Pierce, IL, USA)测定组织和细胞裂解液的蛋白浓度。共分离得到40 μg裂解蛋白,SDS-PAGE分离率为12.5%。电泳后,该蛋白转移到0.22-μM聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将膜与5%脱脂牛奶在室温下孵育1小时,以阻断非特异性结合位点,然后与一抗在4℃下孵育过夜。用TBST彻底清洗膜并与酶标二抗孵育后,再次清洗膜,然后在增强化学发光试剂(Millipore, Billerica, MA, USA)中孵育2-5分钟。使用Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad)检测信号。利用GAPDH或β-Actin校正每个目标蛋白的光密度,并使用Quantity One (Bio-Rad)进行分析。

核转染

当KGN细胞密度达到50%时,用有效的特异性sirna转染细胞Fndc5用RibofectTM CP转染试剂盒(Ribobio,中国),以100nm的浓度为100nm。这Fndc5基因特异性sirna购自中国广州RIBOBIO,其靶向序列如下:si-Fndc5#1,gatggcctccaagaacaaa;Si-Fndc5# 2, GGTGTCATTGCCCTCTTCT;和si -Fndc5# 3, GGAGGATACGGAGTACATA。sirna孵育KGN细胞48小时或72小时后,收集总RNA和蛋白分别进行qRT-PCR和Western blot分析。

阴道灌洗和发情周期测定

观察雌性小鼠的发情周期(Fndc5突变体和野生型)开始于12周大。阴道细胞学检查是通过将无菌拭子浸入水中,然后轻轻地拭子阴道管的外半部进行的。阴道样本转移到载玻片上,风干,用赖特染色液染色,脱水,然后盖住滑片,然后用光学显微镜观察。通过观察阴道涂片中上皮有核细胞、鳞状细胞和白细胞的相对比例来评估小鼠的发情周期。

卵巢收集和卵泡数

所有卵巢标本均无输卵管、脂肪和法氏囊组织。一侧的卵巢立即在−80℃下保存,直到RNA提取和蛋白质定量。另一侧的卵巢在多聚甲醛溶液中固定,进行连续切片和H&E染色。卵巢(每只小鼠一侧)常规石蜡包埋,并对整个卵巢进行连续切片(6-μM厚度)。切片粘在载玻片上,按照标准程序进行H&E染色。每隔3个切片对整个卵巢的卵泡群进行计数,根据卵泡形态划分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、腔卵泡和Graafian卵泡,具体见文献[16]。

激素水平的测量

使用ELISA试剂盒(武汉,武汉,中国)测量血清样品中雌二醇(E2),孕酮(P),卵泡刺激激素(FSH),卵泡刺激激素(FSH)和叶氏素激素(LH)的水平。通过使用ELISA试剂盒(CUSABIO,武汉,中国)确定GH和IGF-1浓度。elisas是根据制造商的指示进行的。此外,在用各种浓度的铱刺激kgn细胞之后,通过使用放射免疫疗法试剂盒(Xin Fan Biotechnology,Shanghai,China)测定培养基中的E2和P的水平。

统计分析

所有数据都显示为平均值±SD。χ2检验用于调查分娩率。使用Tukey测试的方差(ANOVA)的单向分析用于确定实验数据之间的重要性。重复措施Anova用于随着时间的推移分析体重。价值P<0.05被认为是统计学意义。

结果

鸢尾素缺失导致高死亡率和低体重

鸢尾素缺失导致51只雌性突变鼠中31只(死亡率~ 61%)死亡(图。2而杂合子小鼠的死亡率为18.5% (17/92),WT小鼠的死亡率仅为11.4%(5/44)(表1)2)。此外,我们每周将小鼠称重3周至40周龄,发现Fndc5突变小鼠的体重显着减少。在40周龄,Fndc5突变型小鼠的体重比野生型小鼠(分别为24.11±3.37 g和26.78±4.31 g)轻10.0%。2C,D)。为了鉴定升高的死亡率和体重减轻的相关原因,我们测量了小鼠的GH和IGF-1水平。我们发现了Fndc5突变小鼠的GH水平明显高,但低于WT小鼠的IGF-1水平较低(76.55±7.63 pg / ml 54.32±18.44pg / ml; 164.12±5.10ng / ml分别为208.01±6.23ng / ml;P< 0.05)(图2e)。

图2
figure2

鸢尾素缺失影响了大鼠的存活和体重Fndc5突变的老鼠。答:Fndc5突变小鼠表现出高死亡率。存活的百分比(n= 44)和Fndc5突变体(n= 51)老鼠(P< 0.0001)。b:幼崽的外观。c:成年小鼠的出现。d:体重wt = 39,n突变体= 20)。e、F:生长激素(GH)和胰岛素样生长因子I (IGF-1)浓度(n=每组12个);*P与WT小鼠比较,< 0.05

表2 WT和Fndc5突变小鼠的存活率和育性

鸢尾素缺失导致产仔率低

通过交配杂合父母两年,我们获得了二十个女性Fndc5突变小鼠和三十九个女性WT小鼠幸存下来。我们记录了鼠标怀孕,发现了Fndc5突变小鼠比wt(64.1%)具有显着较低的分娩率(15.0%)(P< 0.05)和HT小鼠(58.7%)。WT组和HT组之间没有差异(表1)。

卵巢功能障碍Fndc5突变小鼠

鸢尾素缺失后发情周期受损

为了确定Irisin缺陷是否对雌激循环的发作产生了重要影响,我们分析了小鼠的阴道细胞学。针对每个雌性循环阶段的阴道细胞学的代表性图像如图2所示。3.A,并评估各发情周期小鼠比例。结果表明Fndc5突变型小鼠的不规则周期多于规则周期,这在WT小鼠中存在(图。3.b).发情前的时间Fndc5与野生型小鼠相比,突变型小鼠的寿命延长了(32.5% vs 14.3%,P< 0.05);突变型小鼠的发情时间明显短于野生型小鼠(18.4% vs 35.6%, P < 0.05)。3.c)。

图3
图3

鸢尾素缺失影响发情周期Fndc5突变的老鼠。a:发情周期阶段的示例图像。黄色、红色和蓝色箭头分别表示上皮有核细胞、鳞状细胞和白细胞;200 x。b:各组小鼠有代表性的发情周期(n= 10)。c:发情周期阶段的分布(n = 10)。*与WT小鼠相比P < 0.05

卵巢的外观和组织学

我们的结果表明Fndc5突变型小鼠的卵巢大小和卵巢质量指数明显低于野生型小鼠(7.97±1.65 μl vs 17.11±2.62 μl,P< 0.05;2.50×10- 4.±1.70 × 10- 5% vs 4.00 × 10- 4.±3.97 × 10- 5%,P< 0.05;)(图4a - c)。卵巢也有明显的组织学改变Fndc5突变小鼠(无花果。4F)。用H&E染色的小鼠卵巢序列部分通过计数不同阶段的卵泡的数量来评估,定义为原始,初级,次级,向堤或Grafian卵泡。仲卵球和嗜睡卵泡的比例和嗜睡卵泡到总卵泡Fndc5突变小鼠显着低于WT小鼠(26.8%Vs 78.4%,P< 0.05;分别为19.7%7.2%;P <0.05)(图。4这些数据表明鸢尾素缺失对卵巢发育、排卵和黄体化有不良影响。

图4
图4.

卵巢形态分析。A-C:卵巢的形态学发现。卵巢质量指数=卵巢重量(g)/体重(g);D:通过体内卵巢分析确定的原始卵泡与嗜睡卵泡比(n = 10)确定。E:嗜睡卵泡对总卵泡比(n = 10)。F:H&E在WT和WT的不同阶段的卵泡染色Fndc5突变的老鼠。黑色箭头,原始卵泡;黄色箭头,初生卵泡;红色箭头,窦卵泡。*与WT小鼠相比P < 0.05

卵巢激素水平测定

厌循环的频率,长度和细胞学反映了维持排卵功能的荷尔蒙内云[17]。为了评估IRISIN缺陷小鼠的卵巢功能,通过ELISA评估E2,P和T的血清水平。与wt小鼠相比,Fndc5突变小鼠E2浓度显著降低(12.20±2.86 pg/ml VS 23.13±4.86 pg/ml,P< 0.05)(图5一种)。然而,伊森林删除增加了P级别Fndc5与WT小鼠相比突变小鼠(1.06±0.20ng / ml vs 0.85±0.14ng / ml,P< 0.05,无花果。5b)。睾酮水平与之间相当Fndc5突变和WT小鼠(图。5c).另外,测定FSH和LH水平。结果显示FSH、LH水平明显降低Fndc5突变型小鼠与野生型小鼠的比较(106.84±9.94 ng/ml vs 135.81±22.83 ng/ml;分别为82.58±15.35 ng/ml vs 106.76±19.05 ng/ml;P< 0.05)(图5d,e)。另一方面,体外测定Irisin的效果。我们在KGN细胞的培养基中检查了E2和P浓度。用10-30nm铱处理48小时后,E2的水平在30nM基团中升高约7倍(4.32±0.47pg / ml 0.68±0.15pg / ml后,P< 0.05)(图6b)。然而,与对照刺激相比,P浓度降低10nm铱刺激(0.012±0.001 ng / ml Vs 0.043±0.002 ng / ml,P <0.05)(图。6c).另外,用100 nM的siRNA孵育KGN细胞Fndc5,与对照组相比,E2水平降低,P水平增加(0.34±0.04 pg / ml 0.68±0.15pg / ml,P <0.06±0.002 ng / ml Vs 0.043±0.002 ng / ml,P <0.05;分别)。

图5
图5.

激素浓度Fndc5突变小鼠(每组n = 10)。- 答:雌二醇(e2)。b:孕酮(P) c:睾酮(T) d:卵泡刺激素(FSH)e:促黄体生成素。*与WT小鼠相比P < 0.05

图6
图6.

虹膜对KGN细胞激素产生的影响。将细胞随着浓度的浓度(10-30nm)或Si-Fndc5(100nm)孵育。答:铱刺激了P38和ERK蛋白的磷酸化。B:e2通过特定的放射免疫测定法测量条件培养基中的浓度。C:测量孕酮(P)浓度。数据显示为平均值±SD,(n=每组3个);*与对照组比较P < 0.05

鸢尾素调节激素生产相关蛋白的表达

为了确定鸢尾素参与生殖的分子机制,我们分析了卵巢的转录谱Fndc5突变鼠和WT小鼠通过转录组测序分析。共定量2217个基因,其中差异表达基因1106个(P < 0.05),其中上调基因911个,下调基因195个(图1)。7一种)。

图7
图7.

与生殖相关的mRNA表达在Fndc5突变的老鼠。a:野生型和野生型的卵巢、肌肉和下丘脑的mRNA分析热图Fndc5突变的老鼠。b:下调的mrnaFndc5突变小鼠与类固醇激素的合成有关。c:不同的质谱/质谱Akr1c18,Mamld1CYP19A1Fndc5突变和WT小鼠显示。d:卵巢qRT-PCR结果证实表达降低Akr1c18,Mamld1CYP19A1Fndc5与WT小鼠相比突变小鼠。(n = 5生物学独立Fndc5突变小鼠或WT小鼠)。数据以均数±SD表示;*与WT小鼠相比P < 0.05

在下调基因中,28涉及类固醇激素生物合成,这对于繁殖至关重要(图。7b)。根据文献,其中三种基因,即Aldo-keto还原酶家庭1-成员C1(Akr1c18),类似策划的领域,包含1 (Mamld1)和p450芳香酶(CYP19A1),与性激素的生物合成直接相关[18]。基因本体论(GO)富集结果表明Akr1c18,Mamld1CYP19A1表达量分别下降59.6、64.3和62.5%。7c)。此外,我们证实了mRNA水平Akr1c18,Mamld1CYP19A1Fndc5突变型小鼠的卵巢比野生型小鼠的卵巢分别低57.6、52和64%(图1)。7d)。

为了证实鸢尾素对这三个基因表达的影响,我们将KGN细胞暴露在一系列浓度(10-30 nM)的鸢尾素中48 h。结果表明,在mRNA水平Akr1c18,Mamld1CYP19A1与对照组相比,鸢尾素30 nM处理组的Akr1c18基因表达,2倍上调Mamld1,以及2.1倍的CYP19A1(图。8一种)。始终如一地,在蛋白质水平证实了Irisin的效果(图。8b, c)。另外,检测鸢尾素表达下调是否有助于表达Akr1c18,Mamld1CYP19A1, siRNAs特异性Fndc5设计转染KGN细胞。我们总共测试了三种sirna,并且si-FNDC5#1显著地抑制了sirnaFndc5mRNA水平约80%(图。8d)。该siRNA也显着降低了表达Akr1c18(〜65%),Mamld1(~ 53%)CYP19A1(mRNA和蛋白质水平的〜49%)(图。8e、f)。

图8
图8.

鸢尾素对表达的影响Akr1c18,Mamld1CYP19A1体外。在鸢尾素(10-30 nM)不存在或不存在的情况下培养KGN细胞48小时。a: Irisin增加了the mRNA水平Akr1c18,Mamld1CYP19A1(数据来自存在)。mRNA水平归一化至GAPDH信使rna水平。数据以均数±标准差表示(n = 3)。b, c:将KGN细胞暴露在指定浓度的鸢尾素下72 h后,蛋白水平Akr1c18,Mamld1CYP19A1采用Western blot分析,定量表达蛋白水平。d:转染siRNA 48 h后检测mRNA。e, f:Fndc5,Akr1c18,Mamld1CYP19A1转染72 h后检测蛋白水平的表达(n = 3);*与对照组比较P < 0.05

讨论

鸢尾素通过将白色脂肪组织转化为棕色脂肪组织来调节身体能量消耗[3.]。Binay等人。显示升高的抗芯片水平与增加的BMI,腰部/臀部比率,脂肪百分比和脂肪量相关[19]。在本研究中,伊森林缺乏与雌性小鼠的死亡率增加,减少体重减轻。我们的研究结果表明,伊森林缺乏小鼠的GH水平较高,但血清中的IGF-1水平降低。GH的生物学作用是磷酸,包括增长促进,能源调动,性能,加州发展,食欲和社会行为[20.]。IGF-1是一种生长促进肽,与胰岛素具有重要的结构同源性。GH和IGF-1都是参与胚胎发育和出生后生长的合成代谢激素[21.,22.]。GH诱导IGF-1的合成,IGF-1对GH的释放起到反馈控制作用[23.]。莲等。表明,去除伊森蛋白可以增加垂体细胞中的GH转录物水平[24.]。我们的结果始终表明,IRISIN缺陷小鼠的mRNA水平增加GH的表达(补充图。S1),血清中生长激素水平升高。前期研究表明,鸢尾素与人IGF-1呈正相关,鸢尾素剂量依赖性地增加了原发人骨骼肌细胞IGF-1的表达[25.,26.]。这些结果与我们的发现一致,即紫藤缺乏小鼠在血清中具有较低的IGF-1浓度。Renavillr等人。表明,延长的暴露于GH导致缩小数量的高亲和力生长激素受体(GHR),导致GH抗性和IGF-1减少,显示抗胰岛素效应[27.,28.]。此外,igf结合蛋白(IGF-binding proteins, igfbp) mRNA水平的升高可能是鸢尾素缺陷小鼠IGF-1水平降低的部分原因。血浆中的igfbp与IGF-1结合,促进和/或抑制其作用。已知IGFBP-2和IGFBP-4在代谢中抑制IGF-1活性[29.]。我们的结果表明Fndc5突变小鼠的IGFBP-2、IGFBP-3和IGFBP-4水平在转录水平上升高(补充图。S1)。此外,我们之前的研究表明,缺乏鸢尾素的小鼠IL-6和TNF-α水平更高[30.]。因此,紊乱的GH/IGF-1轴活性和升高的促炎细胞因子可能与鸢尾素缺乏小鼠死亡率的增加和生长发育不良有关。

鸢尾素对生殖系统的影响尚不清楚。在女性中,E2浓度与铱水平呈正相关[25.]。然而,在卵巢切除术(OVX)后雌激素产生较差的情况下,OVX大鼠的鸢尾素水平比对照大鼠高~ 25% [31.]。此外,Irisin可以刺激垂体MPITA12细胞中的LH生产并促进e2卵巢颗粒细胞的产生[10]。Suat等证明鸢尾素通过抑制雄性大鼠的LH和FSH分泌来降低睾酮水平[11]。这些差异可能与品种、性别、鸢尾素浓度等有关。

据我们所知,我们的研究是第一个证明鸢尾素与雌性小鼠繁殖之间联系的报告。在我们的研究中,缺乏鸢尾素的小鼠表现出类固醇激素水平紊乱,窦卵泡比例降低,发情周期不规则,这与雌性小鼠的生育能力下降有关。我们的结果表明,鸢尾素对表达有积极作用Akr1c18,Mamld1CYP19A1在卵巢。Akr1c18是编码20α-羟基甾体脱氢酶(20α-HSD)的基因,该基因将黄体酮转化为非活性代谢物20α-羟基孕酮(20α-OHP) [32.]。piekorz等。表明了这一点Akr1c18小鼠体内的缺失会导致持续的孕酮产生和随后的分娩失败[32.,33.]。我们的结果显示Akr1c18在鸢尾素缺乏的小鼠中,有高黄体血症和孕酮清除减少。Miyado等人发现Akr1c18表达受Mamld1小鼠间质瘤细胞(MLTC1) [18]。我们的结果一致表明Akr1c18表达与Mamld1在KGN细胞中。Mamld1已被证实与MLTC1细胞中睾酮的产生有关,并被发现是导致尿道下裂为显著临床表型的性发育不正常(DSDs)的一个致病基因[34.,35.]。P450芳香化酶(CYP19A1已知是雌激素生物合成中的速率限制酶[36.]。减少表达CYP19A1在鸢尾素缺乏的小鼠中与E2生产体内。鸢尾素对Akr1c18,Mamld1CYP19A1也被证实了体外。伊典可以促进表达Akr1c18,Mamld1CYP19A1在mRNA和蛋白水平上,E2KGN培养液中P水平降低。而鸢尾素的刺激作用被siRNA-抑制Fndc5治疗。

在哺乳动物中,生殖由下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴调节。下丘脑产生GnRH,它调节LH和FSH的合成,这两种激素是从垂体前叶分泌出来的。促性腺激素反过来作用于性腺(卵巢或睾丸)以刺激性腺的发育[2]。E.2和P是负反馈机制的共同中介[37.,38.]。在本研究中,缺乏鸢尾素的小鼠显示出较低的FSH和LH水平,这可能是由于两个原因。首先,泉等人。38.鸢尾素可刺激垂体细胞FSHβ和hl β mRNA的表达。因此,鸢尾素缺乏的小鼠可能直接影响FSH和LH的合成。第二,孕酮是女性GnRH脉冲频率减缓的主要调节因子。例如,黄体生成素(以及GnRH)脉冲频率随着黄体期孕激素水平的增加而减慢[39.,40]。因此,鸢尾素缺陷小鼠的高黄体血症通过负反馈间接抑制FSH和LH的产生。然后,较低的FSH和LH水平对生殖有若干不利影响。例如,卵泡刺激素水平的降低影响了窦卵泡的发育,加重了E2生产。缺乏黄体生成素激增,导致卵母细胞成熟和排卵障碍。在缺乏鸢尾素的小鼠中,E2水平的降低和P水平的升高与动情周期的不规则有关。发情前期时间延长,发情时间缩短Fndc5突变小鼠与繁殖能力差有关。

多囊卵巢综合征(PCOS)是影响育龄妇女最常见的内分泌疾病之一。它不仅与以高雄激素血症和慢性少排卵或无排卵为特征的生殖问题有关,而且与导致肥胖和肥胖相关疾病的代谢改变有关[41.,42.]。胰岛素抵抗(IR)是PCOS和代谢综合征的一个联系因素[43.]。一些研究已经检验了鸢尾素与受试者血糖水平和IR之间的关系。迄今为止,鸢尾素和多囊卵巢综合征的研究结果仍存在争议。大多数研究报道,多囊卵巢综合征(PCOS)妇女的鸢尾素水平高于对照组[44.,45.,46.],而其他一些研究报告了相似[47.,48.或更低[49.与对照组相比,多囊卵巢综合征妇女的循环鸢尾素水平。李等人[44.]表明二甲双胍联合IR可降低PCOS患者循环鸢尾素的含量。需要在谨慎选择的人群和匹配的对照中进行进一步的研究。

在这项研究中Fndc5突变小鼠外观一般正常,但内部功能存在一些问题,如发育不良和繁殖能力差。我们还评估了糖代谢和骨代谢,这将在其他文章中描述。此外,我们编辑了Fndc5基因生成鸢尾素缺失模型。根据我们的方法,虽然在动物模型中肯定没有鸢尾素,但其他部分的功能Fndc5也受到了影响。因此,这种动物模型不是理想的模型。由于技术的限制,我们无法在不影响其他功能的情况下获得去掉鸢尾素的理想模型Fndc5。因此,希望相关的研究小组可以为我们提供这个理想的模型。此外,我们需要进行进一步的繁殖研究,以探索伊森辛和疾病之间的关系。

结论

总之,我们首次证明了Irisin缺乏与小鼠中的内分泌性代谢无序。伊森氏缺乏小鼠表现出增加的死亡率,增长差和发育差,生育率下降。iRisin可能对表达有影响Akr1c18,Mamld1CYP19A1在卵巢中,调节类固醇激素的产生。这项研究为鸢尾素在哺乳动物生长和繁殖中的潜在作用提供了新的见解。

数据和材料的可用性

所有支持数据都是可用性的。

缩写

Fndc5:

纤连蛋白型III型域蛋白5

FSH:

促卵泡激素

LH:

促黄体激素

高压天然气:

下丘脑 - 垂体 - 性腺

IGF-1:

胰岛素样生长因子I

ERK:

细胞外调节蛋白激酶

KGN:

卵巢颗粒组

IGFBPs:

IGF结合蛋白

gnrh:

促性腺激素 - 释放激素

参考文献

  1. 1.

    Puigserver P等。与适应性生热有关的核受体的冷诱导共激活物。细胞。1998;92:829-39。

    CAS文章谷歌学术搜索

  2. 2。

    Shahjahan M, Kitahashi T, Parhar IS。硬骨鱼整合代谢和繁殖的中枢通路。前性(洛桑)。2014年,36。https://doi.org/10.3389/fendo.2014.00036

    文章谷歌学术搜索

  3. 3.

    Bostrom P等。一种依赖pgc1 - α的肌因子,驱动白色脂肪类棕色脂肪的发育和产热。大自然。2012;481:463-8。https://doi.org/10.1038/nature10777

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  4. 4.

    Moreno-Navarrete JM等人。鸢尾素由人体肌肉和脂肪组织表达和产生,与肥胖和胰岛素抵抗有关。临床内分泌杂志。2013;98:E769-78。https://doi.org/10.1210/jc.2012-2749

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  5. 5。

    Roca-Rivada A等人。FNDC5 / IRISIN不仅是肌肌,而且是adipokine。Plos一个。2013; 8:E60563。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0060563

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  6. 6.

    Aydin S等。一个全面的免疫组化检查分布的脂肪燃烧蛋白鸢尾素在生物组织。肽。2014;61:130-6。https://doi.org/10.1016/j.peptides.2014.09.014

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  7. 7.

    Gur FM,Timurkaan S,Yalcin MH,Girgin A,Gencer Tarakci B.摩尔大鼠Irisin的免疫组织化学定位(Spalax Leucodon)。生物技术和组织化学。2017; 92:245-51。https://doi.org/10.1080/10520295.2017.1303194

    CAS文章谷歌学术搜索

  8. 8.

    关键词:Irisin,促性腺激素,罗非鱼,垂体细胞Anim red science . 2017; 185:140-7。https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2017.06.018

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  9. 9.

    Bastu E等。鸢尾素和运动对高脂饮食诱导的肥胖雌性小鼠代谢参数和生殖激素水平的影响。天线转换开关Sci。2018;25:281 - 91。https://doi.org/10.1177/1933719117711264

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  10. 10.

    Poretsky L等。鸢尾素的生殖作用:体外初步研究。天线转换开关杂志。2017;17:285-8。https://doi.org/10.1016/j.repbio.2017.05.011

    文章PubMed.谷歌学术搜索

  11. 11.

    Tekin S等。脑室内注射鸢尾素对雄性大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的影响。J Cell Physiol. 2019; 234:8815-24。https://doi.org/10.1002/JCP.27541

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  12. 12.

    脂肪细胞因子可能延缓人类支持细胞的发育成熟。red Fertil Dev. 2019。https://doi.org/10.1071/RD18487

  13. 13。

    Reinehr T, Elfers C, Lass N, Roth CL。Irisin及其与肥胖儿童胰岛素抵抗和青春期的关系:一项纵向分析。临床内分泌杂志。2015;100:2123-30。https://doi.org/10.1210/jc.2015-1208

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  14. 14。

    ernandez- trejo M, Garcia-Rivas G, Torres-Quintanilla A, Laresgoiti-Servitje E.母亲和新生儿鸢尾素浓度与血清细胞因子的关系。《公共科学图书馆•综合》。2016;11:e0165229。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0165229

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  15. 15.

    张燕,等。鸢尾素通过丝裂原活化蛋白激酶p38 MAP激酶和ERK MAP激酶信号通路刺激白色脂肪细胞褐变。糖尿病。2014;63:514-25。https://doi.org/10.2337/db13-1106

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  16. 16。

    Hernandez-Ochoa i等。芳基烃受体调节小鼠中卵巢卵泡生长和雌二醇生物合成的能力取决于性成熟的阶段。BIOL GROD。2010; 83:698-706。https://doi.org/10.1095/biolreprod.110.087015

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  17. 17.

    Nelson JF, Felicio LS, Randall PK. Sims, C. & finch, C. E.一项关于衰老C57BL/6J小鼠动情周期的纵向研究:i周期频率、长度和阴道细胞学。天线转换开关杂志。1982;27:327-39。https://doi.org/10.1095/biolreprod27.2.327

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  18. 18.

    Miyado M等。缺乏Mamld1小鼠的分娩失败。Sci众议员2015;5:14705。https://doi.org/10.1038/srep14705

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  19. 19.

    血清鸢尾素和催产素水平作为肥胖儿童代谢参数的预测因子。儿科内分泌临床研究杂志。2017; 9:124-31。https://doi.org/10.4274/jcrpe.3963

    文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  20. 20.

    Canosa LF,Chang JP,Peter Re。鱼类生长激素的神经内分泌控制。Gen Compenocrinol。2007; 151:1-26。https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2006.12.010

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  21. 21.

    生长激素和胰岛素样生长因子的生理作用。Orv Hetil。2019;160:1774 - 83。https://doi.org/10.1556/650.2019.31507

    文章PubMed.谷歌学术搜索

  22. 22.

    重组人生长激素佐剂可使非肠道喂养的创伤患者血浆氨基酸恢复正常。JPEN。1995; 19:137-44。https://doi.org/10.1177/0148607195019002137

    CAS文章谷歌学术搜索

  23. 23.

    黄澳,周浩,江勇,高伟基。鱼类生长激素合成和分泌的反馈调节及脑垂体内反馈回路的新概念。Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2006; 144:284-305。https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2005.11.021

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  24. 24.

    莲族,李X,江Q. Irisin抑制绒毛皮脑皮细胞培养的生长激素分泌。mol细胞内分泌。2017; 439:395-406。https://doi.org/10.1016/j.mce.2016.09.030

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  25. 25。

    嗯,j . Y。et al。人体内的FNDC5和鸢尾素:I.血清和血浆循环浓度和II mRNA表达和循环浓度对体重减轻和运动的反应的预测因子https://doi.org/10.1016/j.metabol.2012.09.002(2012)。

  26. 26。

    在人类中,Irisin刺激肌肉生长相关基因并调节脂肪细胞分化和代谢。国际肥胖杂志(2005年)38.,1538-1544,DOI:https://doi.org/10.1038/ijo.2014.42(2014)。

  27. 27。

    Renaville R,Hammadi M,Portetelle D.在哺乳动物代谢中的躯体轴的作用。多国动物endocrinol。2002; 23:351-60。

    CAS文章谷歌学术搜索

  28. 28。

    jogensen JO, Moller L, Krag M, Billestrup N, Christiansen JS。生长激素对人体葡萄糖和脂肪代谢的影响。内分泌杂志2007;36:75-87。https://doi.org/10.1016/j.ecl.2006.11.005

    CAS文章谷歌学术搜索

  29. 29.

    Rajaram S,Baylink DJ,Mohan S.胰岛素样生长因子结合蛋白质在血清和其他生物流体中:调节和功能。EndoCR Rev. 1997; 18:801-31。https://doi.org/10.1210/edrv.18.6.0321

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  30. 30.

    Luo Y等。缺乏鸢尾素的小鼠代谢紊乱。Sci众议员2020;10:17368。https://doi.org/10.1038/s41598-020-74588-7.

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  31. 31.

    Zugel M,等人。性别,肥胖和淋病切除术在伊森松分泌调控中的作用。内分泌。2016; 54:101-10。https://doi.org/10.1007/s12020-016-0913-x

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  32. 32.

    PieCkorz RP,Gingras S,Hoffmeyer A,Ihle Jn,Weinstein Y.通过信号传感器和转录5和20Alpha-羟类脱氢酶的信号传感器和分娩过程中孕孕酮水平的调节。mol内分泌。2005; 19:431-40。https://doi.org/10.1210/me.2004-0302

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  33. 33.

    Mejia R, Waite C, Ascoli M.小鼠黄体中Gq/11的激活是分娩所必需的。摩尔性。2015;29:238-46。https://doi.org/10.1210/me.2014-1324

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  34. 34.

    nakamura m等。MAMLD1敲低减少了小鼠Leydig肿瘤细胞中的睾酮产生和CYP17A1表达。Plos一个。2011; 6:E19123。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0019123

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  35. 35.

    Fukami M,等。CXORF6是缺血的致病基因。NAT Genet。2006; 38:1369-71。https://doi.org/10.1038/ng1900

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  36. 36.

    Kwintkiewicz J,Nishi Y,Yanase T,Giudice LC。过氧化物体增殖物激活的受体-γ介导双酚抑制人颗粒细胞中的FSH刺激的IGF-1,芳族酶和雌二醇。环境健康持态度。2010; 118:400-6。https://doi.org/10.1289/ehp.0901161

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  37. 37。

    Alexandris E等。双侧卵巢切除术后正常女性促性腺激素对促性腺激素释放激素的反应变化。性。1997;47:721-6。

    CAS文章谷歌学术搜索

  38. 38。

    Kazem R等。米非司酮(RU486)对女性垂体对促性腺激素释放激素的影响。哼天线转换开关。1996;11:2585 - 90。https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.humrep.a019174

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  39. 39。

    人类黄体的神经内分泌调节。脉冲性黄体酮分泌证据。临床研究杂志。1984; 73:1638-47。https://doi.org/10.1172/jci111370

    CAS文章PubMed.公共医学中心谷歌学术搜索

  40. 40。

    Filicori M,Santoro N,Merriam Gr,Crowley WF Jr.在整个人体月经周期中的巨突性促性腺激素分泌物的生理模式的表征。J Clin Endocrinol Metab。1986; 62:1136-44。https://doi.org/10.1210/jcem-62-6-1136

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  41. 41。

    胰岛素抵抗与多囊卵巢综合征:机制和发病机制的意义。Endocr启18:774 1997;800年。https://doi.org/10.1210/edrv.18.6.0318

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  42. 42。

    Naderpoor n,等。肥胖和多囊卵巢综合征。Minerva needocrinol。2015; 40:37-51。

    CASPubMed.谷歌学术搜索

  43. 43.

    Chen Ci,等。脂联素和瘦素在超重/肥胖和瘦妇女中具有多囊卵巢综合征。丙酸内科醇。2015; 31:264-8。https://doi.org/10.3109/09513590.2014.984676

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  44. 44.

    李敏等。多囊卵巢综合征妇女中鸢尾素循环水平升高和二甲双胍治疗的效果。临床内分泌杂志。2015;100:1485-93。https://doi.org/10.1210/jc.2014-2544

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  45. 45.

    FODA AA,FODA EA,EL-SELE。卵巢钻探后多囊卵巢综合征中的血清Irisin水平。糖尿病和代谢综合征。2019; 13:1463-8。https://doi.org/10.1016/j.dsx.2019.02.019

    文章谷歌学术搜索

  46. 46.

    Adamska,。et al。多囊卵巢综合征妇女血清鸢尾素及其对高胰岛素血症的调节。内分泌杂志63,1107-1112,DOI:https://doi.org/10.1507/endocrj。ej16 - 0249(2016)。

  47. 47.

    Pukajłok,等。PCOS和健康受试者中的铱血浆浓度与体脂含量和Android脂肪分布有关。丙酸内科醇。2015; 31:907-11。https://doi.org/10.3109 / 09513590.2015.1065482

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  48. 48.

    关键词:多囊卵巢综合征,鸢尾素,骨密度,体成分糖尿病mettab Res Rev. 2016; 32:421-8。https://doi.org/10.1002/dmrr.2767

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

  49. 49。

    Abali R等。多囊卵巢综合征患者循环鸢尾素和Fabp4水平的意义妇产科学杂志。2016; 36:897 - 901。https://doi.org/10.3109/01443615.2016.1174200

    CAS文章PubMed.谷歌学术搜索

下载参考

致谢

在这篇论文的写作过程中,我们对所有帮助过我们的人表示衷心的感谢。

资金

该项目得到了国家自然科学基金(81671421)和国家自然科学基金(81701413)的科学研究项目支持。

作者信息

从属关系

作者

贡献

研究设计:YL、YM、LX。学习行为:YL和XQ。数据分析:YL和YM。手稿起草:YL和YM。原稿修订:徐查尔斯,HD和LX。LX负责数据分析的完整性。作者阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到Liangzhi徐

伦理宣言

伦理批准并同意参与

本研究由中国四川大学中国第二大学医院伦理委员会批准。

同意出版

所有作者同意出版。

相互竞争的利益

作者声明没有竞争利益。

附加信息

出版商的注意事项

新利国际娱乐《自然》杂志对已出版的地图和附属机构的管辖权主张保持中立。

补充信息

附加文件1:图S1。

不同的MS / MS光谱Akr1c18,Mamld1CYP19A1Fndc5突变体和WT小鼠显示GH、IGF-1、IGFBP-2、IGFBP-3和IGFBP-4Fndc5突变和WT小鼠显示。

权利和权限

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引用这篇文章

罗,y。,qiao,x。,马,y。et al。Irisin缺失诱导小鼠生长和生育率降低。天线转换开关性杂志19日,22(2021)。https://doi.org/10.1186/s12958-021-00702-7

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关键字

  • 伊森坦
  • 增长与发展
  • 激素新陈代谢
  • 繁殖
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