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新变种dnah9.导致非综合征严重弱精子症

摘要

背景

哮喘患者是男性不孕症最常见的原因之一,其遗传病因知之甚少。DNAH9是纤毛和鞭毛的外毒素武器的核心成分。据报道,变种dnah9.(OMIM: 603330)可能引起原发性纤毛运动障碍(PCD)。然而,变异dnah9.导致非综合征性严重弱精子症尚未见报道。

方法

对于两个非近亲家族的非肌肤严重哮喘患者的两个个体进行了整个外壳测序(WES),并进行Sanger测序以验证已识别的变异和父母起源。精子常规分析,根据2010年的指引(第5版)进行了精子生命力率和精子形态分析。透射电子显微镜(TEM,TECNAI-10,80 kV,飞利浦,荷兰)用于观察精子尾的超微结构。进行定量实时 - PCR和免疫荧光染色以检测DNAH9-mRNA的表达和DNAH9-蛋白的位置。此外,施用辅助生殖程序。18luck安卓客户端

结果

通过WES和Sanger测序,化合物杂合dnah9.(NM_001372.4)在两种中鉴定出不健瘤严重哮喘患者(F1 II-1:C.302dupt,P.LEU101FS * 47 / C.6956A> G,P.asp2319gly; F2 II-1:C.6294 T > A, p.Phe2098Leu / c.10571 T > A, p.Leu3524Gln). Progressive rates less than 1% with normal sperm morphology rates and normal vitality rates were found in both of the two subjects. No respiratory phenotypes, situs inversus or other malformations were found by detailed medical history, physical examination and lung CT scans etc. Moreover, the expression of DNAH9-mRNA was significantly decreased in sperm from F1 II-1. And expression of DNAH9 is lower in sperm tail by immunofluorescence staining in F1 II-1 compared with normal control. Notably, by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), F1 II-1 and his partner successfully achieved clinical pregnancy.

结论

我们确定了dnah9.作为一种新的非综合征型严重弱精子症的致病基因,ICSI可以促进这些患者良好的妊娠结局。

背景

不孕症是全球问题,影响了8-15%的生育年龄,男性因素可能导致近一半的病例[1,2,3.]。足够的精子活力对于进入雌性生殖器和卵母细胞施肥来说是非常重要的[4]。根据WHO指南(2010),在不同时间至少两次精液分析中,进行性精子活力< 32%或总精子活力< 40%被定义为弱精子症[5]。弱精子症是导致男性不育最常见的因素之一,可能与一些细胞和分子因素有关。首先,鞭毛/纤毛是精子尾部结构的重要组成部分,在精子运动系统中起着至关重要的作用。精子尾部鞭毛/纤毛的结构缺陷直接影响精子的运动能力。其次,离子通道,特别是钙离子通道对精子离子稳态、pH值调节和进行性运动至关重要。第三,线粒体ATP产生障碍也是精子静止不动的主要特征。第四,一些基因突变可能对精子不动性有负面影响。第五,生活方式的危险因素,如吸烟、饮酒、接触化学杀虫剂等[6]。

重度弱精子症定义为进行性精子比例小于1%,是不育症患者的棘手问题[7,8]。以往的研究表明,遗传疾病可能与严重的弱精子症有关。Sha等人发现EIF4G1.(OMIM:600495)是一名患者中严重哮喘患者的候选基因,其精子揭示了线粒体护套缺损[9]。同样,Xu等人。确定了纯合SPAG17(OMIM: 616554)突变与一个家族双胞胎的严重弱精子症相关[10]。此外,AKAP3(OMIM:604689),AKAP4(OMIM:300185),dnah1(OMIM:603332),CATSPER2(人类:607249)nsun7.(OMIM: 6171855)等也被发现与严重弱精子症相关[11,12,13,14,15]。

此外,严重的弱精症也被揭示为原发性纤毛运动障碍(PCD, OMIM: 244400)的代表特征之一,包括呼吸道、精子等广泛的纤毛运动功能障碍。大多数PCD病例与基因突变有关,一些基因已被确定,如dnah5.(人类:603335),dnah9.(人类:603330)DNAH11(OMIM: 603339)等[16,17,18]。dnah9.编码部分外动力蛋白臂(ODA)重链成分,并表达于精子尾部的整个长度[16]。有几项研究报告说dnah9.导致PCD [19,20.]。Fassad等人研究了536例PCD患者,发现3个家庭的4例PCD携带者dnah9.功能流失突变。患有标记的哮喘症患者中的一个,而其他3例患者未受过时的生育率未经测试的生育率[19]。Loges等人。调查了548名具有古典PCD症状或疑似PCD的个体,发现5例突变dnah9。然而,在这些病例中没有进行精子相关检查[20.]。

尽管突变dnah9.已被确定为综合征性弱精症的重要原因,如PCD,两者之间的关系dnah9.尚未检查非合成症的哮喘症。无论dnah9.变异对精子尾部的结构和超微结构有影响,目前尚不清楚。本研究采用全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)对2例中国男性严重非综合征性弱精子症患者进行了研究dnah9.在这两种情况下被确定。

方法

主题

本研究选择2例分别在安徽医科大学第一附属医院生殖中心和厦门妇幼保健院就诊,诊断为重度弱精子症的汉族患者。两组均符合以下几项标准:无明显的pcd相关症状,如慢性咳嗽、呼吸道反复感染、卧位和侧位障碍等;正常体细胞核型(46,XY);精液容量正常(≥1.5 ml),精子浓度(≥15 × 106/ ml),总精子计数(≥39×106/ ml);比例的精子比例<1%;正常精子形态的比例≥4%;具有正常的精子生命力率(≥58%)。具有正常生育率和正常精液特征的两个受试者纳入对照组。收集所有病例的外周整体血液。

伦理批准

本研究由安徽医科大学第一次附属医院和厦门妇幼保医院的伦理委员会批准。所有个人及其家人,以及两名控股在收到了有关该研究的完整信息后签署了书面的同意。

精子分析

精子常规分析、精子活力率和精子形态分析按照世界卫生组织指南2010(第5版)[5]。

WES,生物信息分析和桑格测序

采用全外周血DNA进行WES和生物信息学分析。该协议与之前的研究一致[9,21]。进行Sanger测序以验证已识别的变体和父母起源。引物列于补充表中1

透射电子显微镜法

如前所述制备并处理精子样品[9,21]。随后,采用透射电镜(TEM, tecnai10, 80 kV, Philips, Holland)观察精子尾部的超微结构。

定量实时PCR(QRT-PCR)和免疫荧光染色

参照前人研究,进行DNAH9-mRNA的QRT-PCR实验和精子中dnah9 -蛋白的免疫荧光染色实验[9,21]。抗dnah9的主要抗体为抗动力蛋白重链抗体(ab133968, ABCAM)。引物见补充表2

18luck安卓客户端辅助生殖过程

F1 II-1的配偶接受标准的控制卵巢过度刺激和卵母细胞回收。极少有轻度活动精子被用于随后的胞浆内精子注射(ICSI)。胚胎培养到第5天或第6天。2个月后,移植2个存活的解冻胚胎。胚胎移植后28天超声证实临床妊娠。

结果

在严重弱精子症患者中发现了DNAH9的复合杂合变异

为了检测到这两个患者中严重哮喘患者的原因,进行了WES分析。施用生物信息分析以寻求有意义的纯合或化合物的杂合变体。潜在的致病变体根据标准获得如下:exac_all,1kgp和Gnomad数据库中的等位基因频率<1%;通过从耐受性(SIFT),Polyphen-2和突变填料中的不宽容来预测潜在的高致病性;睾丸极高的表达。生物信息分析后,发现两种病例中的两种情况都携带化合物杂合变体dnah9.,基因中唯一与精子活性相关的基因符合上述条件。随后,Sanger测序的验证dnah9.在两种情况下进行了父母。化合物杂合变体dnah9.在这两个患者中验证,他们的父母被确定为杂合的载体。详细信息呈现在表中1, 图。1补充图1。预测的突变DNAH9残基的三维结构在补充图2由瑞士模型软件(https://swissmodel.expasy.org/)。

表1遗传信息dnah9.两个人的突变
图1
图1

变异的dnah9.这两个病人。a - b受到变体影响的两个家庭dnah9.。红色箭头表示Sanger测序结果中的突变位置。c变异的位置dnah9.在物种中被保守。并且红色箭头表示位置dnah9.变异发生在DNAH9蛋白的结构域。米,dnah9.变体;wt,野生型

两名携带DNAH9复合杂合变异体个体的精子分析和pcd相关症状

表中提出了精子试验的临床特征和结果2。发现两种患者都被发现,比例低于1%,正常精子生命力和正常形态精子率。Papanicolaou染色方法发现了精子尾部的显着缺陷。此外,在这两种情况下,没有PCD相关症状,例如慢性咳嗽,慢性咳嗽,呼吸道,以及SITUS virersus和横向障碍等。并且CT肺筛选显示出F1 II-1的正常结果(补充图3)。为了进一步排除可能的超微结构缺陷,我们对来自F1 II-1的精子进行了TEM。与正常对照相比,在F1 II-1中,在线粒体护套和鞭毛中没有发现明显的缺陷。典型的“9 + 2”微管结构是在F1 II-1和对照中的精子中发现的。同样,在F1 II-1和对照中存在ODA的典型结构(补充图4)。

表2两例患者的临床特征dnah9.突变

f_1精子中DNAH9表达降低

由于未获得F2 II-1的精液,仅检测F1 II-1的精子,以确定变异体的潜在影响dnah9.。在健康对照精子中,免疫荧光染色DNAH9在精子尾部高表达。而F1 II-1精子中DNAH9的表达较低。为了测定DNAH9 mRNA的表达水平,我们进行了QRT-PCR。结果发现,F1 II-1中DNAH9-mRNA表达水平明显低于正常对照(图。2)。

图2
图2.

一个与正常对照相比,F1 - II-1组精子中DNAH9-mRNA的表达明显降低。b精子免疫荧光染色dnah9.- 融资的F1 II-1和正常控制。dnah9.免疫染色(红色)主要集中在精子颈部和鞭毛呈点状,而F1 II-1精子免疫染色减少。赫赫斯特(蓝色)染色作为核标记。抗微管蛋白(绿色)染色作为鞭毛的标记

DNAH9变异患者的妊娠结局

为F1 II-1的妻子进行了标准控制的卵巢过度刺激,卵母线检索和ICSI。检索MII阶段的十六个卵母细胞。所有卵都受精,11种受精卵达到D5 / D6胚胎。随后,在2个月冷冻后转移两种高质量的D5胚胎。在转移后14天内,HCG水平为1300 mIU / ml,通过超声再现胚胎转移28天进行临床妊娠(图。3.)。

图3
图3.

从F1 II-1开始植入胚胎的典型形态。标准胚胎培养后形成质量良好的囊胚,2个胚胎移植入伴侣子宫。胚胎被植入后发生了临床妊娠。一个:2 Pronualclear(PN)施肥,(b): 8细胞期胚胎,(c):胚泡期胚胎。(d):妊娠囊的超声检查。秤栏:40μm

讨论

在本研究中,我们发现2例严重弱精子症患者中存在复合杂合子变异dnah9.。DNAH9的表达在1例dnah9.变体,虽然没有发现明显的形态学和超微结构缺陷。此外,在这两种情况下没有发现其他相关的PCD相关的症状。这些结果提出了这一点dnah9.变异是一种新的非综合征型严重弱精子症遗传病因。

dnah9.该基因是人类轴突动力蛋白β重链基因。该基因全长14kb,有69个外显子dnah9.在纤毛和鞭毛中编码一种蛋白质作为外动力蛋白臂的核心组成部分[22]。由于纤毛或鞭毛在人体细胞和器官的各种品种中高度保守,因此突变dnah9.可能与多系统疾病相关,包括支气管扩张、反复呼吸道感染、男性不育等[16,19,20.,23]。在Fassad等人进行的研究中,所有四名患者携带dnah9.突变具有综合征临床特征,如鼻肌炎,湿咳嗽和situs virersus等[19]。同样,Loges等人也发现在所有5个个体中都存在呼吸表型或侧性缺陷dnah9.突变。然而,只有一个病人dnah9.突变被描述为弱精子症[20.]。在我们的研究中,有两个病例携带dnah9.化合物杂合变体仅呈现严重的哮喘症,没有任何呼吸系统症状或横向缺陷通过系统性病史和身体检查。由于两种情况下没有PCD相关的症状,并且F2 II-1丢失后续后,没有进行一些侵入性程序,例如呼吸道睫状体活检等,以测试其他睫状体的形态或超微结构。尽管如此,据推测,这些患者中至少存在精子运动缺陷dnah9.复合杂合变异体。致病性dnah9.变异导致DNAH9在mRNA和蛋白水平上显著降低,但我们在F1 II-1精子中未观察到明显的超微结构缺陷。这可能与ODA的复杂性有关,ODA由多种重链蛋白组成,包括DNAH5、DNAH8、DNAH11、DNAH17等[19,20.,24,25]。这些正常蛋白质可以形成看似正常的ODA结构,然而,其动态能力急剧受损,导致严重的哮喘患者。这反过来验证了DNAH9在ODA功能中的基本作用。

各种类型的变种dnah9.可能导致不同的疾病表型和不同的纤毛缺陷。这两例患者的临床表型与其他患者相比不那么严重dnah9.具有古典PCD症状的突变。在这两种情况下,鉴定的化合物杂合变体包括畸形变体,较温和的遗传缺陷,这可能仅对DNAH9的结构和功能进行轻微有害影响。因此,在这两种情况下仅介绍了严重的精子活力缺陷。通过F1 II-1的精子中的正常形态和超微结构部分地支持。与小群岛和Loges等的研究不同,这两个患者没有发现横向缺陷。DNAH9是ODA的重要核心,其突变可能导致纤毛运动受损,随后在胚胎节点内的左侧流体流动受损或受到干扰的液体流动。因此,近一半的PCD患者患者SITUS Inversus。另外,较温和的遗传缺陷dnah9.在这两种情况下,可能对胚胎淋巴结内的液体流动影响不大。这些因素可能有助于这两例患者的正常侧位。尽管dnah9,其他一些PCD候选基因的不同变异也可能导致不同的表型。dnah1是内臂重链动力蛋白的核心组成部分,也被认为是导致PCD的候选基因[26,27]。同样的,12个病人dnah1变体仅表现出鞭毛(MMAF)表型的多种形态异常,但是在SHA等人进行的研究中没有PCD。[28]。

严重的哮喘患者是一种罕见的疾病,辅助生殖技术(艺术品),特别是ICSI是这些患者怀孕的重要甚至唯一的方法。F1 II-1的妻子也得到了检查dnah9.基因,未发现异常变异。考虑到常染色体隐性遗传模式,F1 - 2 -1对夫妇接受了标准的ICSI程序,并取得了良好的临床结果。这也是首次报道ICSI可以推荐用于由严重弱精子症引起的dnah9.变体。

也应该考虑到一些限制。首先,无法获得F2 II-1的精子样本。所以所有的精子实验都是在F1 II-1中进行的。此外,没有收集呼吸纤毛作为进一步实验的侵入性程序。其次,由于精子样本不足,未进行western blot实验检测F1 II-1中DNAH9蛋白表达水平。第三,我们没有调查患病率dnah9.在非综合征型严重弱精子症大人群中的变异,这将是未来的一项重要工作。

结论

综上所述,dnah9.是一种新的致病因素,不仅是综合征严重的哮喘症,如PCD,还具有非正式症严重的哮喘症。可以推荐ICSI作为这些患者有利的妊娠结果的一线治疗。

可用性数据和材料

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。

缩写

PCD:

原发性纤毛运动障碍

韦斯:

全外显子组测序

透射电镜:

透射电子显微镜法

ICSI:

胞浆内精子注射

奥达:

外部Dynein Arm.

存在:

定量实时PCR

筛:

从宽容中排序

MMAF:

鞭毛的多种形态异常

艺术:

辅助生殖技术

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下载参考

确认

不适用。

资金

本研究得到了中国国家重点研发计划(2019年第2019YFC1005106),中国安徽省自然科学基金(2019年第19085杆至355号)和中国国家自然科学基金(No.81901541)。

作者信息

从属关系

贡献

YC, XH, DT和YS设计了这项研究。DT, YS, CX和HG收集数据。YG、JZ分析WES和Sanger测序数据。DT、HC、JZ、XN进行QRT-PCR和免疫荧光染色实验。DT, YS和YG写了这篇论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应于小金他选手曹

道德声明

参与的伦理批准和同意

本研究经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会和厦门市妇幼保健院伦理委员会批准通过。

同意出版

所有个人及其家人,以及两名控股在收到了有关该研究的完整信息后签署了书面的同意。

相互竞争的利益

两位作者声明,他们没有相互竞争的利益。

附加信息

出版商的注意事项

新利国际娱乐施普林格自然对已出版地图和机构附属机构的管辖权主张保持中立。

补充信息

附加文件1:补充表1

。用于验证的引物dnah9.突变。

附加文件2:补充表2

。用于DNAH9和β-肌动蛋白的QRT-PCR测定的引物。

附加文件3:补充图1. 1。

Sanger测序结果是两种病例和父母。

附加文件4:补充图2。

SWISS-MODEL软件预测突变DNAH9残基的三维结构(https://swissmodel.expasy.org/);wt,野生型。

附加文件5:补充图3。

诊断性影像学检查排除了典型的PCD症状。(A):胸部X光片显示心脏在左侧。(B):胸部CT示肺支气管正常。(C):上腹部CT示内脏结构规则。

附加文件6:补充图4。

F1 II-1中的精子形态和超微结构dnah9.复合杂合变异体。(a - d)来自正常生育能力的健康男性的正常精子。(E-H)严重弱精症的F1 - II-1精子。精子形态分析显示对照者(A)和F1 II-1 (E)正常长鞭毛,TEM显示对照者(B-D)和F1 II-1 (F-H)精子中典型的“9 + 2”微管结构和正常的外动力蛋白臂。比例尺:10 μm in (A)和(E);在(B-D)和(F-H)中有1um。CP,微管中心对;PM,外周微管双峰;ODF,外密光纤;女士,线粒体鞘; TEM, transmission electron microscopy.

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唐,D.,Sha,Y.,Gao,Y.等等。新变种dnah9.导致非综合征严重弱精子症。天线转换开关性杂志19日,27(2021)。https://doi.org/10.1186/s12958-021-00709-0

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关键词

  • Asthenozoospermia
  • Nonsyndromic
  • 鞭毛
  • dnah9.
  • ICSI.
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