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Hsp90通过Erk1/2和p38 MAPK信号通路调节人类精子获能GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

热休克蛋白90 (Heat shock protein 90, Hsp90)是一种丰富的真核分子伴侣,在客户蛋白成熟、蛋白折叠和降解以及信号转导中发挥重要作用。之前,我们发现Hsp90及其共同伴侣细胞分裂周期蛋白37 (Cdc37)在人类精子中均有表达。已知Hsp90通过未知的潜在机制参与了人类精子获能。由于Cdc37是Hsp90激酶特异性的共同伴侣,Hsp90可能通过其他激酶调节人类精子获能。据报道,两种主要的丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs),细胞外信号调节激酶1/2 (Erk1/2)和p38,在人类精子中与Hsp90和Cdc37在相同的位置表达。磷酸化的Erk1/2已被证明能促进精子的过度活跃和顶体反应,而磷酸化的p38则抑制精子活力。因此,在本研究中,我们探讨了Hsp90是否通过Erk1/2和p38 MAPK信号通路调节人类精子获能。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

在电容期间用HSP90特异性抑制剂17- allylamino-17-脱昔昔洛昔尼霉素(17-AAG)处理人精子。计算机辅助精子分析仪(CASA)用于检测精子运动和多动激活。通过使用荧光素异硫氰酸酯 - 缀合分析精子取骨反应GydF4y2BaPisum一GydF4y2Ba凝集素(PSA-FITC)染色。使用共免疫沉淀(CO-IP)实验评估HSP90,CDC37,ERK1 / 2和P38之间的相互作用。用于评估蛋白质表达和磷酸化水平的蛋白质印迹分析。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

17-AAG抑制人精子大激活和副骨反应,表明HSP90参与人体精子的能量。此外,共同IP实验表明,17-AAG降低了HSP90和CDC37之间的相互作用,导致来自HSP90-CDC37蛋白质复合物的ERK1 / 2的解离。Western印迹分析显示,随后降低了ERK1 / 2的水平及其磷酸化形式。降低HSP90-CDC37复合体也影响了HSP90和P38之间的相互作用。然而,P38与HSP90蛋白质复合物解离并通过自磷酸化活化。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果表明,HSP90参与人体精子大激活和副反应。特别地,HSP90及其共伴侣CDC37与ERK1 / 2和P38形成蛋白质复合物,以调节它们的激酶活性。这些结果表明,HSP90通过ERK1 / 2和P38 MAPK信号通路调节人体精子电容。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

刚被射精的精子不能施肥卵母细胞,必须在女性生殖道中进行一系列生化和生理事件,以成为受精能力。该过程称为精子电容[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba].电容精子通常表现出蛋白质酪氨酸磷酸化,多动运动和副疗法反应引发[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba它有助于精子与卵母细胞的融合。一般认为,精子获能始于质膜内胆固醇的流出,从而增加了膜的通透性[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].增加了CA的涌入GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba和HCOGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba活化可溶性腺苷酸环化酶(sAC) [GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba],催化ATP转化为营地。随后,CAMP激活营养依赖性蛋白激酶A(PKA),其激活靶蛋白并促进蛋白酪氨酸磷酸化[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].然而,在人类精子获能过程中作用于PKA下游的机制仍不清楚。GydF4y2Ba

热休克蛋白90 (Heat shock protein 90, Hsp90)是一种丰富的真核分子伴侣,在细胞生理的各个方面发挥着重要作用,包括客户蛋白成熟、蛋白折叠和降解、信号转导以及多蛋白复合物的组装[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba].最近,Zierer等人。证明HSP90在电池信号中心的各种客户蛋白的激活中起关键作用[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba].以前,我们发现HSP90主要表达在人体精子的颈部,中间件和尾部区域中[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba].格尔德霉素是一种特异性的Hsp90抑制剂,已被证明可以中断人类精子获能,改变蛋白质酪氨酸磷酸化水平,并降低过度活化运动和顶体反应。此外,其他研究发现,Hsp90水平在少弱精子症中被下调,Hsp90的功能抑制可以减弱孕酮介导的精子活力和顶体反应[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba].然而,其潜在机制仍不清楚。GydF4y2Ba

细胞分裂周期37 (Cell division cycle 37, Cdc37)是热休克蛋白90的一个重要的激酶特异性共同伴侣,它作为一个适配器并将其加载到热休克蛋白90复合物上,在许多激酶的成熟过程中起着至关重要的作用[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba].在体细胞中,Cdc37已被证明在翻译过程中或翻译后不久与激酶结合,并将其招募到Hsp90蛋白复合物中,从而保护激酶免受蛋白酶体降解并保持其活性[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba].最近,我们发现Cdc37在人类精子的颈部和尾部区域表达,这些区域也含有Hsp90,这表明这些蛋白可能在人类精子获能过程中相互作用调节激酶活性[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba].许多激酶在HSP90的帮助下通过蛋白质磷酸化调节精子功能;例如,PKA和蛋白激酶C(PKC)在精子中磷酸化合物Hsp90,其在电容过程中调节非受体酪氨酸激酶SRC [GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联在许多细胞反应的信号转导中起着关键作用,包括后生动物的发育、分化、生存、迁移、增殖、生长和凋亡[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba].哺乳动物MAPK级联由三层主要的蛋白激酶组成,即地图激酶激酶激酶(MAP3KS),MAP激酶激酶(MAP2KS)和MAPK,其可以依次被激活,以磷酸化下游效应,例如转录因子,以及影响细胞分化,细胞运动,细胞死亡和细胞内贩运[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba].至少有三个MAPK蛋白质家族,包括细胞外信号调节激酶1/2(ERK1 / 2),P38和C-JUM N-末端激酶1-3(JNK1-3)[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba[MAPK途径中的许多蛋白质与HSP90相互作用[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba].ERK1 / 2和P38,但不是JNK1 / 2,在成熟的人体精子的尾部区域中被检测到[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba],与Hsp90和Cdc37一致。此外,许多研究表明Erk1/2和p38参与调控精子活力:磷酸化的Erk1/2促进精子活力和过度活跃的活力,而磷酸化的p38抑制精子活力[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba].Erk1/2和p38在顶体反应中均发挥积极作用[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba],表明MAPK通路可能在受精前调节雌性生殖道的获能和顶体反应。GydF4y2Ba

由于MAPK级联中的蛋白质是所有激酶,我们探讨了HSP90及其激酶特异性共伴侣CDC37在人体精子的能量期间调节MAPK途径。本研究的结果将有助于我们理解HSP90调节精子电容的机制。GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

化学品和试剂GydF4y2Ba

Percoll购自GE Healthcare Biosciences AB(瑞典乌普萨拉)。十二烷基硫酸钠裂解缓冲液(用于蛋白质印迹,P0013g),细胞裂解缓冲液(用于共免疫沉淀(Co-IP),P0013),以及用于十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的所有其他试剂从Beyotime生物技术机构(中国上海)获得了Western Blotting。蛋白质加载缓冲液,ECL加上化学发光试剂盒和预染色的蛋白质标记购自Thermo Fisher Scientific Inc.(美国伯灵顿,美国伯灵顿)。蛋白A + G琼脂糖是从Santa Cruz Biotechnology Inc.获得的(达拉斯,德克萨斯州,美国)。黄体酮和荧光素异硫氰酸酯 - 共轭GydF4y2BaPisum一GydF4y2BaAgglutinin(PSA-FITC)购自Sigma-Aldrich(ST路易斯,MO,USA)。从默克(德国达姆施塔特)获得二甲基砜(DMSO)。17- allylamino-17-Demethoxygeldanamycin(17-Aag)由细胞信号技术(Danvers,Ma,USA)提供。完全迷你EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾酒来自罗氏(Mannheim,德国)。小鼠单克隆抗ERK1 / 2抗体(SC514302),小鼠单克隆抗P-ERK1 / 2(磷光体T202 / 185和Y204 / 187)抗体(SC81492)和抗CDC37抗体(SC13129)购自Santa Cruz Biotechnology公司;购买兔单克隆抗P38抗体(AB170099),兔多克隆抗P-P38(磷光体T180和Y182)抗体(AB4822),兔单克隆抗HSP90抗体(AB203126)和兔抗β-微管蛋白抗体(AB6046)被购买来自阿坝(剑桥,英国)。从Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)购买辣根过氧化物酶(HRP)凝固酶(HRP)抗兔和山羊抗小鼠IgG。GydF4y2Ba

人输卵管液(HTF)培养基GydF4y2Ba

HTF培养基的制备如前所述[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba].它在整个研究中用于处理精子,由90 mM NaCl, 5.06 mM KCl, 1.80 mM钙离子组成GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,25.3毫米NahcoGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,1.01 mm mgsoGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,1.17 mm khGydF4y2Ba2GydF4y2Ba阿宝GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba、葡萄糖5.56 mM、乳酸钠21.6 mM、丙酮酸钠0.27 mM、Hepes 20 mM、牛血清白蛋白(BSA) 4 g/L、青霉素60 mg/L、酚红5 mg/L。用氢氧化钠(NaOH)或盐酸(HCl)调节培养基pH至7.4。这里提到的所有化学品都是西格玛-奥德里奇提供的。GydF4y2Ba

精液收集和精子治疗GydF4y2Ba

本研究经浙江医学科学院医学伦理委员会批准。在Semen样品收集之前获得了知情同意,形成健康的男性捐赠者(25至35岁)。新鲜的精液样品通过在性禁欲后的手淫获得3-5天,并在37℃下液化1小时以进行后续加工。根据世界卫生组织(世卫组织)要求,本研究中的精子样品达到以下标准:精子运动≥50%,精子存活率≥85%,精子浓度≥20×10GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba精子/ ml,形态学正常精子≥15%。精液以750×以40%和80%的不连续的控股梯度离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba15分钟去除死子和细胞碎片。将沉淀物重悬于HTF培养基中,以500×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba5分钟,并调整为约20×10的密度GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba在HTF中补充有2.5μm黄体酮的精子/ mL。将精子分为用不同浓度的17-AAG(0.5μm或5μm,DMSO作为载体对照)处理的等分试样,并在5%CO中培养GydF4y2Ba2GydF4y2Ba在37°C恒温恒湿培养箱中培养3小时。GydF4y2Ba

评估精子电容GydF4y2Ba

由于仅电容精子经历外尿量,因此使用孕酮诱导的牙科体反应间接评估人体精子。根据人体精液的检查和加工WHO实验室手册(第5次),通过PSA-FITC染色评估了取物反应。在电容培养后,用95%乙醇固定精子30分钟,安装在硅烷 - 制备载玻片上,然后在4时空气干燥并在黑暗中孵育过夜GydF4y2BaO.GydF4y2Bac用25 mg / l psa-fitc。用PBS洗涤精子并通过荧光显微镜检查(GydF4y2BaNGydF4y2Ba > 200 sperm/sample) (Nikon Eclipse 80i; Nikon Inc., Tokyo, Japan).

精子动力和多动激活分析GydF4y2Ba

使用计算机辅助精子分析仪(CASA;IVOS, Hamilton-Thorne生物科学公司,Beverly, MA, USA),参数如下:帧速率,60hz;收购框架,30;最低的对比,80;最小单元格大小,3像素;细胞密度,40;路径速度,25.0µm/s;直线度阈值,80%;慢细胞、平均路径速度(VAP)和直线速度(VSL)分别小于5.0µm/s和11µm/s;光照强度,2164; magnification, 1.73 ×; temperature, 37 ˚C; and chamber depth, 20 µm (n>GydF4y2Ba 200 motile sperm per sample). Briefly, sperm samples (5 µL) were loaded into 20-µm deep of slides chambers warmed to 37 ˚C and the following parameters were assessed: VSL, VAP, curvilinear velocity (VCL), straightness (STR = VSL/VAP × 100), linearity (LIN = VSL/VCL × 100), amplitude of lateral head displacement (ALH), beat-cross frequency (BCF), and the percentage of motile, progressive, and hyperactivated sperm. Sperm hyperactivation was defined using the SORT function as follows: VCL ≥ 150 µm/s; ALH ≥ 7.0 µm; and LIN ≤ 50 %.

蛋白质提取GydF4y2Ba

根据我们之前报道的方法,用PBS洗涤精子两次,并在包含蛋白酶抑制剂(完全迷你无edta蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾酒)和1mm苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解缓冲液中重悬。超声处理后,14000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba收集20分钟并收集上清液。使用双链烷基酸(BCA)测定试剂盒(BeyoTime生物技术机构)测定蛋白质浓度。GydF4y2Ba

共同IP实验GydF4y2Ba

对于CO-IP,通过超声蛋白在裂解缓冲液中萃取精子蛋白,其补充有20mM钼酸钠(NAGydF4y2Ba2GydF4y2BaMoo.GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba), 1% Nonidet P-40 (NP-40), 1 mM PMSF,罗氏Complete Mini EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒,磷酸酶抑制剂鸡尾酒。约500µg蛋白裂解液与1µg兔或小鼠IgG和20µL蛋白A + g琼脂糖珠在4℃下旋转2 h, 1000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba5分钟。将每个上清液与2μg抗CDC37,抗ERK1 / 2或抗P38抗体混合,然后在4的旋转下孵育GydF4y2BaοGydF4y2BaC过夜。接下来,将40μl蛋白A + G琼脂糖珠加入混合物中并轻轻旋转5小时以捕获抗原抗体复合物。通过以1000×离心分离沉淀物GydF4y2BaGGydF4y2Ba5 min,琼脂糖珠用裂解缓冲液洗涤5次,与5 ×上样缓冲液混合,100℃煮沸10 min电泳准备。GydF4y2Ba

Western Blotting.GydF4y2Ba

通过在100℃下与蛋白质加载缓冲液温育10分钟并通过SDS-PAGE与分子量标记的预染色蛋白梯一起孵育10分钟,通过将来自蛋白质负载缓冲液进行变性的等量的琼脂糖珠,并通过SDS-PAGE分离为分子量标记.将蛋白质转移到免疫印刷膜(Millipore Corporation,Bedford,Massachusetts,USA)中,其在室温下浸入5%脱脂牛奶(M / V)中的5%脱脂牛奶(M / V)中1小时,将特异性抗体与ERK1 / 2,磷光体-ERK1 / 2,P38,磷光体-P38或Hsp90一起温育过夜。在用补充0.01%Tween-20(v / v)的Tbs以5分钟的间隔进行三次洗涤后,将膜与室温下的适当的二抗孵育1小时,然后洗涤另外三次。使用具有凝胶成像系统(Amersham Imager 600; General Electric Company,USA)的增强化学发光(ECL)试剂盒(Thermo Fisher Scientific)检测蛋白质印迹。作为加载控制,剥离膜以探测β-微管蛋白抗体。使用Image J软件分析灰色强度。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

使用社会科学软件的统计包进行统计分析(SPSS,版本23; IBM Corporation,Armonk,NY,USA)。数据表示为平均值(SEM)的平均值±标准误差。单向分析方差分析用于统计分析。当对异常的均匀性测试是显着的时(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05), data were analyzed using Dunnett’s T3 test; otherwise, the least significant difference test was used. AllP.GydF4y2Ba值基于双面比较,并且<0.05的值被认为是统计学意义。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

17-AAG抑制人类精子的电容GydF4y2Ba

之前,我们发现格尔德霉素影响人类精子获能[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba];因此,在本研究中,我们检测了格尔德霉素衍生物和特异性Hsp90抑制剂17-AAG对人类精子获能的影响。由于获能精子总是表现出高度活化和顶体反应,我们利用顶体反应和过活化试验间接评估了17-AAG对人类精子获能的影响。PSA-FITC染色可以很容易地区分顶体反应(AR)的精子和顶体完整性(AI)的精子(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种)。当在电容过程中用5μm17-AAG处理人精子时,比用DMSO处理(载体对照;图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05). When sperm motility and hyperactivation were evaluated using CASA, we found that 5 µM 17-AAG markedly decreased sperm hyperactivation (Fig.1GydF4y2BaC,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05). Detailed sperm motility parameters are summarized in Table1GydF4y2Ba.这些结果与我们之前的发现一致,并表明HSP90通过未知的潜在机制起到人体精子的作用。GydF4y2Ba

表1 17 - AAG对人精子运动参数的影响GydF4y2Ba
图。1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

17-AAG抑制人精子顶体反应和过度活化。GydF4y2Ba一个。GydF4y2Ba人类精子顶体反应采用PSA-FITC染色进行评估,这是一种基于精子头部染色改变评估精子获能的常用方法。顶体反应(AR)表示有能力和顶体反应的精子,顶体完整性(AI)表示无能力的精子。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba.当人精子用5μm17-α-载体对照处理人的精子时,取物反应百分比显着降低(*GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05).CGydF4y2Ba.用CASA分析精子活力和过活化。5µm17 - aag处理后精子活力亢进率明显低于对照(*GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05)

17-AAG降低了Hsp90-Cdc37蛋白复合物的水平GydF4y2Ba

Cdc37是一种激酶特异性的Hsp90共同伴侣,它将激酶招募到Hsp90-Cdc37蛋白复合物中,以保持其活性或稳定性[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].为了确定HSP90是否通过稳定ERK1 / 2和P38来调节人体精子的产物或激活它们的激酶活性,首先通过用或没有5μm17-AAG治疗3小时,通过将精子治疗精子在人体精子催化期间检查HSP90和CDC37之间的相互作用。其次是CO-IP。HSP90的大小约为90千寸。在非免疫小鼠IgG和Hsp90之间未观察到相互作用,而HSP90和CDC37之间明显明显是明显的相互作用(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).我们还发现17-AAG治疗后,Hsp90与Cdc37之间的相互作用显著降低。用5µm17 - aag(* .)处理后,Hsp90与Cdc37的相关性为65%左右GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)(图GydF4y2Ba2GydF4y2Bab),表明在17-AAG存在时,Hsp90-Cdc37蛋白复合物水平下降,与Hsp90-Cdc37结合的激酶可能与复合物分离。GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
figure2GydF4y2Ba

HSP90与其共伴侣CDC37在人体精子之间的相互作用。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba.使用蛋白质印迹和具有针对CDC37的非免疫小鼠IgG或抗体的蛋白质印迹和Co-IP,在精子裂解物中检测到HSP90。在非免疫小鼠IgG和Hsp90之间没有观察到相互作用,而HSP90和CDC37之间明显明显的相互作用。17-AAG干扰了HSP90-CDC37复合物的形成。结果代表三种独立实验,使用来自三种不同个体的样品。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba.人精子获能过程中Hsp90和Cdc37与5µm17 - aag的相关关系GydF4y2Ba

17-AAG使Erk1/2与Hsp90分离并降解GydF4y2Ba

已知ERK1 / 2位于人体精子的尾部区域并调节电容[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba];因此,我们使用共同IP和Western印迹检查了HSP90和ERK1 / 2之间的相互作用。在IgG对照和HSP90之间没有观察到相互作用,并且ERK1 / 2和HSP90之间的尚明相互作用是明显的(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba一种)。此外,17-AAG显着降低了HSP90和ERK1 / 2之间的相互作用。HSP90与ERK1 / 2之间的相对关联在用5μm17-aag处理时约为控制的25%(*GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)(图GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab),表明ERK1 / 2从HSP90复合物中解离。GydF4y2Ba

图3.GydF4y2Ba
图3GydF4y2Ba

人类精子获能过程中Hsp90和Erk1/2的相互作用。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba.使用蛋白质印迹和与ERK1 / 2的非免疫小鼠IgG或抗体的蛋白质印迹和共同IP在精子裂解物中检测到Hsp90。在非免疫小鼠IgG和HSP90之间没有观察到相互作用,而HSP90和ERK1 / 2之间明显明显的相互作用。17-AAG显着破坏了HSP90和ERK1 / 2之间的相互作用。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba.HSP90和ERK1 / 2的相对关联在人体精子电容期间有或没有5μm17-aagGydF4y2Ba

Erk1/2 Thr202/185和Tyr204/187位点的磷酸化是酶激活所必需的[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba)和磷酸化的Erk1/2 (p-Erk1/2)已被证明能促进人类精子的运动性、过度活跃的运动性和顶体反应。为了确定精子获能过程中Hsp90如何调节Erk1/2功能,我们检测了17-AAG对Erk1/2及其磷酸化形式的影响。取精子分为5组:对照组0 h,获能3 h, DMSO处理3 h(载体对照),0.5µM或5µM 17-AAG处理3 h。裂解后,用SDS-PAGE分离蛋白,并进行western blotting分析。我们发现17-AAG处理后p-Erk1/2水平下降(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa,上),如在电容期间17℃处理3小时后的ERK1 / 2表达(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一个,中间)。因此,我们检查了P-ERK1 / 2至ERK1 / 2的致密度比率,在17-AAG处理和对照组之间没有显着差异(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)。然而,ERK1 / 2至β-微管蛋白的密度测量比在载体控制(DMSO)基团和用5μm17-AAG处理的精子之间显着不同(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC,GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05), suggesting that Erk1/2 was degraded in human sperm treated with 17-AAG.

图4.GydF4y2Ba
装具GydF4y2Ba

17-AAG影响人类精子获能过程中总和磷酸化Erk1/2 (p-Erk1/2)的表达。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba.western blotting检测17-AAG对p-Erk1/2和Ekr1/2的影响。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba.p-Erk1/2与Erk1/2的密度计比。各组间差异无统计学意义。数据代表平均值±SEM (GydF4y2BaNGydF4y2Ba= 3)三个独立实验。GydF4y2BaCGydF4y2Ba.ERK1 / 2至β-微管蛋白的密度计量。用17-AAG(5μm)处理的精子显着降低ERK1 / 2表达而不是载体控制(*GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05). Data represent the mean ± SEM (NGydF4y2Ba= 3)三个独立实验GydF4y2Ba

这些研究结果在一起表明,在电容过程中用17℃治疗人体精子破坏了Hsp90和ERK1 / 2之间的相互作用。在没有分子伴侣Hsp90的情况下,ERK1 / 2可以变得不稳定并且降解,与所观察到的ERK1 / 2表达的降低一致。由于用17 AAG处理时ERK1 / 2的表达水平降低,因此P-ERK1 / 2的水平降低;ERK1 / 2的酶活性也下降。由于P-ERK1 / 2促进了多动运动和取饰反应,因此通过干扰ERK1 / 2活性,17-AAG可以抑制人体精子的能量,而HSP90促进电容过程中的ERK1 / 2稳定性和激酶活化。GydF4y2Ba

17-AAG导致P38从HSP90中解离并通过磷酸化激活GydF4y2Ba

与ERK1 / 2一样,P38也位于人类精子的尾部,沿HSP90和CDC37 [GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba].为了阐明Hsp90在人类精子获能过程中调控p38的机制,我们研究了17-AAG处理的精子中Hsp90和p38之间的相互作用(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba).与预期的一样,对照IgG与Hsp90之间没有相互作用;而在获能过程中,Hsp90与p38相互作用密切,加入17-AAG后相互作用明显减弱。用5µM 17-AAG (*GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05), suggesting that p38 dissociated from Hsp90.

图5.GydF4y2Ba
figure5GydF4y2Ba

人体精子加固期间HSP90和P38之间的相互作用。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba.在精子裂解物中检测HSP90,使用蛋白质印迹和具有针对P38的非免疫兔IgG或抗体的Co-IP。在非免疫兔IgG和HSP90之间没有观察到相互作用,而HSP90和P38之间存在明显的相互作用,其显着破坏了17°AAG。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba.HSP90和P38之间的相互作用在人体精子电容期间有或没有5μm17-aagGydF4y2Ba

已知p38​​抑制精子的前致和多动运动,并且参与人体精子施加期间的取饰反应。MAPKS由上游激酶的Thr-X-Tyr主题的磷酸化激活;特别地,P38通过TYR323的磷酸化激活,随后的THR180和TYR182的自磷酸化[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba].在本研究中,我们使用western blotting检测了17-AAG对p38表达和磷酸化的影响。精子被分为五组:控制0 h,精子获能3 h, DMSO溶液处理对3 h(车辆控制),和处理0.5µM或5µM 17-AAG 3 h。我们发现phosphorylated-p38 (p-p38)水平显著增加精子获能后3 h,而17-AAG p-p38水平进一步增加(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一个,上)但没有改变p38表达(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一个,中间)。接下来,我们检查P-P38和P38之间的密度计量比,发现P38在电容后激活3小时,并且17-AAG促进P38活性(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab)但不是p38表达(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC)。GydF4y2Ba

图6.GydF4y2Ba
figure6GydF4y2Ba

17-AAG在人体精子加固期间影响总和磷酸化的P38(P-P38)表达。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba.使用蛋白质印迹测定17-AAG对P-P38和P38的影响。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba.p-p38与p38的密度比。17-AAG(5µM)处理的精子p-p38水平显著高于对照(*GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05). Data represent the mean ± SEM (NGydF4y2Ba= 3)三个独立实验。GydF4y2BaCGydF4y2Ba.p38与β-微管蛋白的密度比。各组间差异无统计学意义。数据代表平均值±SEM (GydF4y2BaNGydF4y2Ba= 3)三个独立实验GydF4y2Ba

总之,这些结果表明,在人类精子获能过程中,Hsp90通过抑制p38的磷酸化和抑制其激酶活性与p38相互作用。当p38从Hsp90复合物解离时,它被Thr180和Tyr182位点磷酸化激活。由于p-p38在获能过程中抑制精子活力和过度活跃的活力,17-AAG对p38磷酸化的放大可能进一步抑制精子活力。GydF4y2Ba

讨论GydF4y2Ba

获能是精子在雌性生殖道中经历一系列生化和生理事件使卵母细胞受精的过程。这是人类精子受精的先决条件[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba].电容机制复杂,包括胆固醇的流出,离子渗透性和蛋白质磷酸化的调节。在电容后,精子出现多动激活和取饰反应,这使得精子融合成卵母细胞。加利福尼亚州GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba对调节人类精子获能、精子活力和顶体反应至关重要。在获能初期,细胞内Ca含量增加GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba和HCOGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba激活可溶性腺苷酸环化酶(sAC),它催化ATP成cAMP;cAMP随后激活PKA, PKA激活靶蛋白,促进蛋白酪氨酸磷酸化并诱导获能(图)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba].然而,在人类精子获能过程中作用于PKA下游的机制仍不清楚。GydF4y2Ba

图7.GydF4y2Ba
figure7GydF4y2Ba

HSP90通过ERK1 / 2和P38信号途径调制人体精子电容GydF4y2Ba

在人体精子的能量期间,来自质子膜的胆固醇流出增加,增加了膜渗透性,从而增加了CA的膨胀GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba和HCOGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba活化的可溶性腺苷酸环化酶(sAC),催化ATP转化为cAMP。随后,cAMP激活cAMP依赖的蛋白激酶A (PKA), PKA激活靶蛋白如Hsp90。激活的Hsp90及其激酶特异性的共同伴侣Cdc37与Erk1/2形成蛋白复合物,稳定Erk1/2并维持其磷酸化。磷酸化的Erk1/2被激活,促进精子过度活化和顶体反应。Hsp90和Cdc37还与p38形成蛋白复合物,维持未磷酸化的p38。由于磷酸化的p38被激活并抑制精子的过度活化,Hsp90-Cdc37-Erk1/2-p38复合物促进人类精子获能。用Hsp90特异性抑制剂17-AAG处理后,Erk1/2和p38从复合物中分离。Erk1/2随后被降解和去磷酸化,而p38通过自磷酸化激活自身。最终,这些变化抑制了人类精子的获能GydF4y2Ba

HSP90以各种细胞类型普遍表达,并通过与客户蛋白相互作用来发挥关键作用[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba].以前,我们发现HSP90以人体精子表达,主要是颈部和尾部区域的局部化。通过使用Geldanamycin,HSP90特异性抑制剂,我们已经证明HSP90参与细胞内钙稳态,调节蛋白酪氨酸磷酸化,精子多动运动,以及响应于孕酮的毒物反应[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba].本研究在精子获能期间用格尔德霉素衍生物17-AAG(另一种Hsp90特异性抑制剂)处理人类精子,而精子获能培养的程序与我们之前的工作一致。我们一致发现,17-AAG也影响顶体反应和人类精子的过度活化,表明热休克蛋白90调节人类精子获能。然而,其机制尚不清楚。GydF4y2Ba

之前报道,大约60%的人类牛仔组织与Hsp90相互作用[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba[借助于其激酶特异性CDC37,CDC37通过用作适配器并募集到HSP90蛋白质复合物的促进激酶成熟。在许多肿瘤细胞中,CDC37过表达是致癌的[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba],因为它介导激酶的招募到Hsp90系统并维持它们的酶活性。最近,我们发现Cdc37在人类精子中与Hsp90在同一位置表达。Hsp90与Cdc37相互作用,并在人类精子获能过程中被PKA磷酸化[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba];因此,我们假设HSP90可以通过CDC37的帮助,通过重要的激酶途径下游PKA进一步调节人体精子。GydF4y2Ba

在本研究中,我们证实了Hsp90和Cdc37在人类精子获能过程中相互作用。Hsp90和Cdc37之间的相互作用是通过结合Hsp90的中间区域到Cdc37的n端区域来介导的[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba].当用17-AAG处理人类精子时,Hsp90- cdc37蛋白复合物的水平显著降低(与对照组相比约65%)(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba).以前的研究发现,17 AAG及其类似物Geldanamycin并没有破坏HSP90和CDC37之间的相互作用[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba];然而,我们观察到免疫沉淀Cdc37复合物经17-AAG处理后Hsp90水平下降。之前,我们发现格尔德霉素以剂量依赖的方式降低精子中Hsp90的表达[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba],而其他研究发现17-AAG在膀胱癌细胞翻译后水平下调Hsp90的表达[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba].因为17- aag是格尔德霉素衍生物,在支架结构的17位有一个烯丙基氨基,具有类似的生物作用[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba], 17-AAG可能通过降低人类精子中Hsp90的表达来降低Hsp90- cdc37的水平,从而解释了这种差异。总之,这些发现表明,在人类精子获能过程中,17-AAG降低了Hsp90-Cdc37蛋白复合物的水平,从而影响了通过Cdc37募集到Hsp90-Cdc37的激酶。GydF4y2Ba

我们还发现,17 AAG显着地中断了HSP90和ERK1 / 2之间的人体精子之间的相互作用(与对照相比〜25%)(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)并且导致比HSP90和CDC37之间更大的解离。这些发现表明,对于HSP90-ERK1 / 2复合物观察到的减少是由HSP90表达的降低和HSP90和ERK1 / 2之间破坏的相互作用引起的。Eckl等人。还观察到ERK2与HSP90-CDC37复合物相互作用[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba,这与我们的发现一致。GydF4y2Ba

在人类精子中加入17-AAG后,Erk1/2从Hsp90复合物中分离并降解,从而降低了Erk1/2的活化(p-Erk1/2)。对人类膀胱癌细胞的研究也报道了总和磷酸化的Erk1/2蛋白水平以17- aag依赖的方式降低[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba];然而,在17-AAG处理后的总ERK1 / 2的水平取决于细胞类型或细胞系[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba].因此,Erk1/2水平的降低可能取决于细胞类型、17-AAG浓度和孵育时间。在本研究中,Hsp90促进了人类精子中Erk1/2的稳定性和活性,而先前的报道表明Erk1/2磷酸化促进了精子活力和顶体反应[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba].因此,17-AAG可以通过破坏HSP90-CDC37-ERK1 / 2复合物并影响ERK1 / 2稳定性,从而降低活性磷酸化ERK1 / 2的水平。GydF4y2Ba

在人精子获能过程中,17-AAG可降低Hsp90和p38之间的相互作用;然而,当p38与Hsp90-Cdc37复合物分离时,其Thr180和Tyr182位点的磷酸化增加。此前,Ota等证实p38与Cdc37相互作用,从而被招募到心肌细胞的Hsp90-Cdc37复合物中;Hsp90抑制导致p38从Hsp90复合物中分离,并随后通过自磷酸化激活其[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba].在成骨细胞中,已显示Geldanamycin和17 Aag以剂量依赖的方式显着增强磷酸化的P38水平[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba].总的来说,这些结果支持了17-AAG治疗导致p38从人类精子的Hsp90-Cdc37复合物中分离并通过自磷酸化激活自身的可能性。此外,p-p38已被证明能抑制精子活力,这可能解释了为什么17-AAG能抑制人类精子过度活跃的活力。虽然p-p38也能促进顶体反应,但17-AAG最终抑制了人精子获能。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

总之,本研究的发现表明,特定的HSP90抑制剂17-AAG通过破坏HSP90-CDC37和MAPK激酶ERK1 / 2和P38之间的相互作用来影响人体精子的能量。特别地,通过减少总和和P-ERK1 / 2水平并增加P-P38水平,17-AAG抑制电容(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba).为我们的知识,这是第一次报告HSP90通过ERK1 / 2和P38 MAPK信号通路调节人体精子电容的研究。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

研究期间使用的所有数据可通过请求从相应的作者获得。GydF4y2Ba

缩写GydF4y2Ba

HSP90:GydF4y2Ba

热休克蛋白90GydF4y2Ba

CDC37:GydF4y2Ba

细胞分裂周期蛋白37GydF4y2Ba

MAPKs:GydF4y2Ba

丝裂原激活蛋白激酶GydF4y2Ba

Erk1/2:GydF4y2Ba

细胞外信号调节激酶1/2GydF4y2Ba

17-AAG:GydF4y2Ba

17-allylamino-17-demethoxygeldanamycinGydF4y2Ba

PSA-FITC:GydF4y2Ba

异硫氰酸荧光素偶联大豆凝集素GydF4y2Ba

SAC:GydF4y2Ba

可溶的腺苷酸环酶GydF4y2Ba

PKA:GydF4y2Ba

蛋白激酶A.GydF4y2Ba

PKC:GydF4y2Ba

蛋白激酶C.GydF4y2Ba

MAP3Ks:GydF4y2Ba

地图激酶激酶激酶GydF4y2Ba

MAP2Ks:GydF4y2Ba

地图激酶激酶GydF4y2Ba

JNK1-3:GydF4y2Ba

c-Jun n末端激酶1-3GydF4y2Ba

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    Tamura S,Marunouchi T,Tanonaka K.热冲击蛋白90通过激活Mapk途径调节心室肥大。J Mol Cell Cardiol。2019年2月; 127:134-42。GydF4y2Ba

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    (1)田志平,田志平,田志平,等。HSP90抑制剂增强细胞外atp刺激的成骨细胞白介素‐6的合成:p38 MAP激酶的扩增。《细胞生物化学与功能》,2020。GydF4y2Ba

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致谢GydF4y2Ba

我们感谢所有参与本研究的捐助者。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

国家自然科学基金资助项目(No. 81771647, No. 81801525, No. 81571426);浙江省卫生科技计划项目(No. 2018KY039, No. 2019KY363);浙江省科研机构专项(C11920D-04)、浙江省高层次卫生创新型人才培养计划、杭州医学院创业基金资助项目(No. 713713516);C11904Q-04)。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

PS、YW和YN设计了本研究;PS、YW、TG、KL、DZ和AL进行了实验;PS、YW、YN对数据进行分析;PS起草论文;所有作者阅读并批准提交和最终版本。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba雅尼GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

伦理宣言GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

本研究经浙江医学科学院医学伦理委员会批准。知情同意由健康的男性捐助者签署。GydF4y2Ba

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不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

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孙平,王勇,高涛。GydF4y2Ba等等。GydF4y2BaHSP90通过ERK1 / 2和P38 MAPK信号通路调节人体精子电容。GydF4y2Ba饲养Biol内分泌GydF4y2Ba19,GydF4y2Ba39(2021)。https://doi.org/10.1186/s12958-021-00723-2GydF4y2Ba

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关键词GydF4y2Ba

  • 精子获能的精子GydF4y2Ba
  • HSP90.GydF4y2Ba
  • Erk1/2GydF4y2Ba
  • P38.GydF4y2Ba
  • MAPK信号通路GydF4y2Ba
  • 磷酸化GydF4y2Ba
\GydF4y2Ba